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上海源葉生物科技有限公司
中級會員 | 第15年
抗體片段及其衍生形式2012/06/09
1.雙特異性抗體將兩套輕鏈、重鏈基因?qū)牍撬枇黾毎?,選擇合適的抗體恒定區(qū)及Ig類型,可獲得產(chǎn)量大、均一性和高純度的雙特異性抗體。另外,以化學(xué)交聯(lián)技術(shù)或雜交—雜交瘤技術(shù)也可獲得雙特異性抗體。2.Fab抗體Fab抗體是由重鏈Fd(即VM+CHl)和完整輕鏈通過二硫鍵結(jié)合而成的異二聚體,僅含一個抗原結(jié)合部位。將重鏈Fd和完整輕鏈的編碼基因連接,5,端融合細菌蛋白信號肽基因可在大腸桿菌內(nèi)分泌型表達,形成完整的立體折疊和鏈內(nèi)、鏈間二硫鍵,保持Fab片段的功能。3.Fv抗體其制備原理是:分別構(gòu)建含VH和V
主要組織相容性復(fù)合體2012/06/09
主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是由一組高度多態(tài)性基因組成的染色體區(qū)域。MHC基因產(chǎn)物能在不同細胞表面表達,通常稱之為MHC分子或MHC抗原,又因這些抗原在器官移植中代表供受者雙方的組織相容程度,也稱為移植抗原或組織相容性抗原。脊椎動物中,從魚到人類都存在結(jié)構(gòu)與功能相似的MHC遺傳區(qū)域,如小鼠的MHC是H-2,堵的MHC是SLA,人的MHC是HLA。MHC是現(xiàn)知多態(tài)性zui為豐富的一個基因系統(tǒng),擁有大量的等位基因,賦予種群巨大潛力以適應(yīng)多變的內(nèi)外環(huán)境。MHC分子不但在T細胞分化發(fā)育中是必需的,而且
吸光和發(fā)光組織樣品的常用測量參數(shù)2012/06/04
像素是顯微圖像分析系統(tǒng)的zui小測量單位,通過它我們不僅能夠得到待測范圍內(nèi)的幾何形態(tài)信息,如面積、周長和直徑等等,還可根據(jù)樣品是否能夠吸光或發(fā)光來測量其物質(zhì)的總含量。在組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)中常用熒光素來標記物質(zhì),使被測量物質(zhì)產(chǎn)生有色熒光,從而進行分析。此外,在原位雜交技術(shù)中,采用放射自顯影的標本也可以作為發(fā)光組織細胞樣品使用顯微圖像分析系統(tǒng)進行分析。(一)眼光組織細胞樣品的測量對于吸光組織細胞樣品,圖像分析系統(tǒng)至少能以下列三種參數(shù)來表述細胞待測物質(zhì)的計量結(jié)果:1.積分光密度(integrate
酶免疫電泳技術(shù)2012/06/02
一,酶免疫電泳技術(shù)的原理抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中電泳時,在堿性緩沖液的條件下,抗原帶負電,向正極移動。不同分子量或還不同電荷的抗原,在相同條件下,移動距離不等。這些在不同部位的抗原,再與相關(guān)抗體經(jīng)擴散形成免疫沉淀線。酶免疫電泳技術(shù)中的抗原與抗體就是酶和它的相應(yīng)抗體球蛋白。酶抗原與酶抗體形成的免疫復(fù)合物是用底物顯色的,由于酶反應(yīng)的高度靈敏性,使酶免疫電泳技術(shù)成為一項靈敏度高的檢測技術(shù),但僅局限于酶蛋白的分析鑒定。二,辣根過氧化物酶(HRP)免疫電泳技術(shù)的程序1,器材與設(shè)備電泳儀(包括電泳槽);溫箱
活細胞間接免疫熒光法2012/06/02
一.實驗器材:1.器材:40孔塑料板、40孔板離心機、微量加樣器、振蕩器、蓋玻片、熒光顯微鏡等。2.試劑:單抗隆抗體(單抗)、熒光標記抗鼠免疫球蛋白、PBS(pH7.2-7.4)、甘油、疊氮鈉(NaN3)等。二.方法(微量法)1.將分離好的單個核細胞用PBS洗2次,1000rpm每次10分鐘。用含0.1%NaN3PBS調(diào)細胞濃度在0.5-1×108/ml(5000萬-1億/ml),加在40孔板上,每孔10ul,含5-10×105細胞,然后加入單抗(*抗體)50ul(同時加入AB型血清5ul)振蕩
DNA合成儀的發(fā)展2012/05/19
當前DNA合成儀的主要生產(chǎn)廠商都致力于機器性能的完善和應(yīng)用領(lǐng)域的開拓以及率、高產(chǎn)率的儀器的開發(fā)與研究。中國臺灣科學(xué)委員會“基因醫(yī)藥衛(wèi)生科技研究計劃”中的基因生物技術(shù)組已經(jīng)成功研發(fā)**臺高密度復(fù)制DNA合成儀,可以同時合成384條不同DNA,每日可合成768條DNA,并可以配合聚合酶連鎖反應(yīng)裝置,大量復(fù)制各種基因,不但節(jié)省時間,也可節(jié)省大量人力,這部機器能復(fù)制動物、人體、植物的基因甚至是防偽基因。由于人們所需要的大部分核酸的堿基對數(shù)量遠遠超過目前DNA合成儀可以合成的zui長核酸鏈的堿基對數(shù)量,因
多肽合成的基本原理2012/05/19
多肽合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程,合成一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。過去,多肽合成是在溶液中進行,現(xiàn)在多采用固相合成法從而大大地減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。為防止副反應(yīng)的發(fā)生,合成柱與添加的氨基酸的側(cè)鏈都被保護,羧基端是游離的,且在反應(yīng)之前必須活化。化學(xué)合成方法有兩種,即Fmoc法和Boc法。由于Fmoc比Boc有很多優(yōu)勢,現(xiàn)在大多采用Fmoc法合成。甲基化聚苯乙烯樹脂,目前,廣泛采用比氯甲基樹脂更加穩(wěn)定的對乙酰氨基芐酯(PAM)樹脂。合成肽酰胺時采用二苯甲胺型樹脂。Boc保護?!?
特異性循環(huán)免疫復(fù)合物的測定2012/05/12
特異性CIC分為單特異性CIC和雙特異性CIC兩類。前者適用于檢測已知抗原及其相應(yīng)抗體組成的CIC。雙特異性CIC是指對組成CIC的抗原、抗體和補體中某兩種成分組合明確的CIC,常采用的檢測方法為ELISA和RIA技術(shù),需要兩種特異性各異的抗體。因此,檢測要求條件較高,但能較全面地反映CIC的病理意義。在檢測雙特異性CIC時,由于要求有兩種特異性抗體,每種抗體均可用作包被或檢測抗體,故具體到檢測某類雙特異性CIC時,根據(jù)兩種抗體的不同,可使用兩種方法。以ELISA法為例,如檢測HBsAg/IgC
胰蛋白酶解離法檢測HBsAg-CIC2012/05/12
用3.5%PEG選擇性地沉淀血清中CIC,繼之用胰蛋白酶消化沉淀物中的抗體蛋白,分離出抗原部分,用反向間接血凝法測定HBsAg滴度。與不加胰蛋白酶的對照管比較,如HBsAg滴度升高,則說明有HBsAg-CIC的存在。1.試劑①pH8.4硼酸鹽緩沖液(BBS):配制法同*節(jié)中PEG沉淀試驗;②7%PEG及3.5%PEG溶液:用BBS配制;③10mg/mL胰蛋白酶溶液:用pH8.2巴比妥緩沖液配制。2.操作步驟(1)在測定管與對照管內(nèi)務(wù)加待測血清0.2mL。(2)兩管各加pH8.4BBSl.8mL,
IL-16的檢測2012/05/05
即以前的淋巴細胞趨化因子(1ymphocytechemoattractantfactor,LCF)。主要由CD8+T淋巴細胞產(chǎn)生,對T淋巴細胞特別是CD4+細胞具有選擇性趨化作用。(1)IL-16的誘生1)分離PBMC,調(diào)整細胞濃度為3X106/mL,加入平底培養(yǎng)板中,置37℃5%C02溫箱培養(yǎng)。2)加入血清素(serotonin,即5-羥色胺),使終濃度為10—4moL/L,培養(yǎng)24h,離心收獲上清用于IL-16活性檢測。(2)IL-16的測定:可根據(jù)IL-16對淋巴細胞的趨化作用測定其活性。
IL-17的檢測2012/05/05
IL-17是新近被確認的一種細胞因子,由T細胞,主要是CD4+T細胞產(chǎn)生,其靶細胞廣泛??杉せ钷D(zhuǎn)錄因子NF-KB,誘導(dǎo)纖維母細胞產(chǎn)生IL-6、ID8、GM-CSF、和膜性細胞間粘附分子1(1CAM-1),促進由亞適劑量PHA所誘導(dǎo)的T細胞增殖。目前編碼IL-17及其受體的基因核苷酸序列已被部分測定。(1)IL-17的誘導(dǎo):取人PBMC或純化的CD4+T細胞,加入誘導(dǎo)劑(PMA5ng/mL+ionomycin3ug/mL,或ConA63ug/mL,或抗CD28抗體+CD3抗體),37℃孵育48—7
三條途徑對C3轉(zhuǎn)化酶的激活2012/04/21
1.經(jīng)典途徑始于抗體(主要是IgM和I知)對病原體或細胞表面抗原分子的識別及抗原抗體復(fù)合物的形成。補體C1q分子結(jié)合抗體后觸發(fā)這一經(jīng)典途徑。C1q和Clr、Cls共同組成O復(fù)合物(圖7d3A),Clr和Os隨著Clq的活化而依次激活。Cls活化后專一性地使下列兩個補體成分分解:出分解成FAa,和Ob;C2分解成C2a和C2l被激活的兩個大片段C4b和C2b迅速沉積到細胞表面,共同構(gòu)成經(jīng)典途徑中顯示酶解活性的C3轉(zhuǎn)化酶即C4b2b。補體Cl復(fù)合體及攻膜復(fù)合物形成過程示意圖2.凝集素途徑由甘露糖結(jié)合
補體的效應(yīng)功能和補體級聯(lián)反應(yīng)中的后期事件2012/04/21
1.介導(dǎo)炎癥反應(yīng)斟、C3、C5分解產(chǎn)生的小片段CAa、C3a和C作為一種肽介導(dǎo)物(peptidemediator)參與誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng),起著招募吞噬細胞的作用。2.調(diào)理作用C3是血漿中濃度zui高的補體蛋白,含量為1.2mg/ml。一個C3轉(zhuǎn)化酶可以分解1000個C3分子,由此產(chǎn)生大量的C3b。C3b憑借其暴露出來的硫酯鍵,以共價形式結(jié)合于病原體表面,否則C3b將因水解而失活。因而補體激活的一個重要結(jié)果,是使C3b大量沉積和覆蓋在病原體或靶細胞的表面。另一方面,吞噬細胞帶有識別C3b的受體,有利
吞噬防御屏障2012/04/14
吞噬細胞攝入胞外物質(zhì)主要有兩種形式:胞吞和吞噬。(1)胞吞(endocytosis):指胞外組織液中的大分子被細胞攝人。其方式又有兩種,分別稱為胞飲(扛nocytosis)和受體介導(dǎo)的胞吞(圖7—17)。前者直接吞人可溶性大分子;后者選擇性地吞人受體—大分子復(fù)合物。隨后,帶有大分子的胞吞小泡相互融合而進入內(nèi)體(endosome)。內(nèi)體中的酸性內(nèi)含物使大分子和受體分子解離,后者可再循環(huán)至細胞表面,而帶有游離大分子的內(nèi)體則和來自高爾基體的初級溶酶體(1ysosome)融合成為次級溶酶體。溶酶體內(nèi)含有
血漿酶炎癥介質(zhì)2012/04/14
炎癥是針對各種刺激物如感染和組織損傷的一種生理性應(yīng)答。有三個重要作用:①把效應(yīng)分子和效應(yīng)細胞輸送到感染部位,增強防御*線M甲對入侵病原體的殺傷;②提供一個生理屏障,防止感染擴散(抗感染炎癥屏障);③加快損傷組織的修復(fù)。參與炎癥反應(yīng)的介質(zhì)主要包括趨化因子、細胞因子、血漿酶介質(zhì)和脂類炎癥介質(zhì)。血漿酶介質(zhì)血漿中有四個酶系統(tǒng),在一旦出現(xiàn)組織損傷時可被激活而形成相互作用的網(wǎng)絡(luò),產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)。血漿酶介質(zhì)及其在炎癥反應(yīng)中的作用(1)激肽系統(tǒng):組織損傷首先激活血漿酶原Hageman因子(又稱凝血因子Ⅻ),引
基于細胞物理性狀的免疫細胞分離方法2012/04/07
1、根據(jù)各種細胞比重的差異(1)自然沉降法(2)密度梯度離心法①Ficoll-Hypaque密度梯度離心法:人外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)包括淋巴細胞和單核細胞,其體積、形狀和比重與其他細胞不同,紅細胞和多核白細胞比重較大,為1.092左右,而淋巴細胞和單個核細胞比重為1.075左右。利用密度在1.077±0.001g/L之間近于等滲的Ficoll-Hypaque混合溶液(稱為淋巴細胞分層液)作密度梯度離心時,各種血液成分將按密度梯
MTT比色法檢測IL-2的生物活性2012/03/10
【基本原理】IL-2的生物活性檢測法是檢測IL-2對靶細胞(或反應(yīng)細胞)的促增殖作用的能力。IL-2反應(yīng)細胞增殖程度可以增殖細胞中DNA合成或酶活性為指示系統(tǒng),通過測定3H-TdRDNA摻入量或MTT比色法OD值,并通過與標準品對照,間接測定IL-2的生物活性單位。以下三類細胞可作為IL-2的檢測細胞:①IL-2依賴細胞株,如CTLL,CTLL-2,尤以后者zui常用;②有絲分裂原活化的T淋巴母細胞;③小鼠胸腺細胞。下面主要介紹以CTLL-2細胞作為反應(yīng)細胞檢測IL-2的生物學(xué)活性,又包括MTT
3H-TdR摻入法檢測IL-2的生物活性2012/03/10
【材料和試劑】(1)反應(yīng)細胞:CTLL-2,存活率應(yīng)>95%。(2)IL-2標準品:倍比稀釋為不同濃度。(3)待測樣品:倍比稀釋為不同濃度。(4)10%Fcs-RPMI-1640*培養(yǎng)液(5)3H-TdR(6)96孔培養(yǎng)板,刻度吸管,毛細吸管,刻度離心管,離心機,加樣器(頭),細胞計數(shù)板,倒置顯微鏡,超凈工作臺,CO2培養(yǎng)箱,微量細胞收集儀,玻璃纖維濾紙,?液閃計數(shù)儀。【操作步驟】(1)用10%FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌CTLL-2細胞2次,1000r/min離心5min,以去除原生長
基本術(shù)語和常用測量參數(shù)2012/03/03
(一)像素與灰度1.像素是構(gòu)成顯示器圖像的zui基本單元,按行和列(X和Y)方向排列成矩列。任何一矩列均對應(yīng)一個點,這些點稱為像素。單位面積屏幕上像素愈多則圖像愈清晰,即分辨率愈高,顯示的圖像也越細膩和真實。數(shù)字圖像的像素越多,灰度量化等級也越多,圖像分析儀分析出的結(jié)果越準確。但是。當像素達到一定量時,由于圖像分析儀計算機的存儲量和計算量呈幾何級數(shù)增大,從而減慢了計算機的處理速度。2.灰度系指圖像每一像素的明暗(深淺)程度,即該像素的圖像由黑到白變化的量化等級。顯微圖像分析系統(tǒng)的灰度量化等級均為
流式細胞術(shù)的常用樣品制備方法2012/02/25
流式細胞術(shù)的實驗檢測對象是單細胞懸液,因此,在組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)實驗中欲對待測樣品細胞進行分類計數(shù),也需把樣品制備成細胞懸液,并要求被檢細胞大小為0.2~80pm,每個樣品中至少有20000個細胞,細胞濃度為105~107個/ml。制備成的單細胞懸液經(jīng)熒光或免疫熒光標記即可上機檢測。1.單層培養(yǎng)細胞單細胞懸液的制備(1)棄去培養(yǎng)細胞(對數(shù)生長期)中的舊培養(yǎng)液,加入1~2ml0.25%胰蛋白酶,倒置顯微鏡下觀察,見細胞稍變圓時,停止胰蛋白酶作用。也可直接觀察培養(yǎng)瓶,靜置消化2~3分鐘,待細胞逐
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