Na+K+- ATP 酶活性測(cè)定說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/24 樣

Na+K+- ATP 酶活性測(cè)定 氧化磷酸化

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

Na⁺K⁺- ATP 酶廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物和細(xì)胞中，可催化ATP 水解生成ADP 和無(wú)機(jī)磷。

測(cè)定原理：

Na⁺K⁺-ATP 酶分解ATP 生成ADP 及無(wú)機(jī)磷，通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量來(lái)確定ATP 酶活性。

試劑的組成和配制：

試劑四：粉劑×3 支，-20℃保存。用時(shí)每支加 1ml 蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑七：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入 25ml 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周；試劑八：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入 25ml 蒸餾水，溶解后 4℃保存一周；

0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將貯備液 20 倍稀釋?zhuān)慈?0.1ml 試劑十加 1.9ml 蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制：按 H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

需自備的儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣品酶液的制備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

操作步驟:

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)（在EP 管中加入下列試劑）：

混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴 10min;

混勻，8000g，25℃離心 10min，取上清液; 3、定磷(在 1.5mlEP 管中依次加入下列試劑)

混勻，室溫放置 30 min，在 660nm 處比色。

注意:

1、由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照，本試劑盒 50 管保證測(cè) 24 份Na+K+-ATP 酶。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格無(wú)磷。

3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

計(jì)算:

1、血清（漿）Na+K+-     ATPase 活力的計(jì)算:

定義：每小時(shí)每毫升血清（漿）中Na+K+- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na+K+-ATP 酶活力（μmol/h/ml）=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷V 樣÷T=7.5×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中Na+K+- ATPase 活力的計(jì)算：

按蛋白濃度計(jì)算：

定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白中 Na+K+- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na+K+-ATP 酶活力(μmol/h /mg)= [C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷（Cpr×V 樣）÷T =7.5×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

定義：每小時(shí)每克組織中Na+K+-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na+K+-ATP 酶活力(μmol/h/g)= [C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總]×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=7.5×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

定義：每小時(shí)每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞中Na+K+-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生 1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na+K+-ATP 酶活力(μmol/h /104)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）÷(500×V樣÷V 樣總)÷T=0.015×（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/ml；V 總：酶促反應(yīng)總體積，0.5ml；V 樣：加入樣本體積，0.2ml ； V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1/6 小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重， g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

Na+K+- ATP 酶活性測(cè)定 氧化磷酸化