引言

在單克隆細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，手動(dòng)有限稀釋法是經(jīng)典的分離單細(xì)胞手段之一。這種方式分離單細(xì)胞，每個(gè)孔中落進(jìn)去的細(xì)胞數(shù)目符合泊松分布。依靠單細(xì)胞分選儀器分離單細(xì)胞的效率，無論從分選能力還是重復(fù)性都要明顯優(yōu)于手動(dòng)的有限稀釋方法。測(cè)定一款設(shè)備分選效率的標(biāo)準(zhǔn)方法，是用熒光校準(zhǔn)微球來分選檢驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)方法

Namocell單細(xì)胞分離儀通過檢測(cè)FITC熒光信號(hào)，來分選熒光校準(zhǔn)微球（Spherotech）和用Calcein AM（Thermo Fisher Scientific）染色的CHO-S細(xì)胞。對(duì)于分離的細(xì)胞可以用Calcein AM染色，用于區(qū)分碎片、死細(xì)胞和活細(xì)胞，然后可以根據(jù)Namocell推薦的操作流程分離單個(gè)活細(xì)胞。為了去除細(xì)胞結(jié)團(tuán)，在染色之后可以用40um左右的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾細(xì)胞，盡量保證在上樣的時(shí)候樣本都是單個(gè)細(xì)胞。作為對(duì)照，我們采用1cell/well的細(xì)胞密度進(jìn)行手動(dòng)有限稀釋法鋪板。然后，用顯微鏡在明場(chǎng)下觀察每個(gè)孔的細(xì)胞（或者微球）的數(shù)量。同樣的實(shí)驗(yàn)持續(xù)7天，每天做一組對(duì)比實(shí)驗(yàn)，后取平均值。通過統(tǒng)計(jì)孔板中單細(xì)胞、兩個(gè)細(xì)胞和空孔的數(shù)量來衡量?jī)x器的分選效率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

在圖例中展示了，用Namocell單細(xì)胞分離儀分離的微球和細(xì)胞以及手動(dòng)鋪板的數(shù)據(jù)對(duì)比。通過Namocell單細(xì)胞分離儀分選的熒光微球保持了很好的一致性---單細(xì)胞97%，兩個(gè)細(xì)胞1%，空白2%。通過Namocell單細(xì)胞分離儀分選的細(xì)胞樣本---單細(xì)胞93%，兩個(gè)細(xì)胞2%，空白5%。對(duì)照樣本數(shù)據(jù)，通過手動(dòng)有限稀釋法得到的分選效率---單細(xì)胞31%，兩個(gè)細(xì)胞35%，空白34%。

在細(xì)胞樣本的分散程度比較好的狀態(tài)下，機(jī)器分離的高單細(xì)胞比例是97%。對(duì)于手動(dòng)有限稀釋法而言，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致性比較差（通過標(biāo)準(zhǔn)差可以看出）。綜上所述，Namocell單細(xì)胞分離儀的分選效率和一致性要遠(yuǎn)優(yōu)于手動(dòng)有限稀釋法。

圖例：機(jī)器分離的微球和細(xì)胞的平均分選效率和手動(dòng)分離的對(duì)比。