小鼠核酸氧化8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）ELISA分析試劑盒產(chǎn)品說明書

（中文版）

主要用途

 小鼠核酸氧化8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）ELISA分析試劑是一種旨在使用單克隆抗8-羥基脫氧鳥苷抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合樣品中的8-羥基脫氧鳥苷，進(jìn)而使用辣根過氧化酶綴合二抗，由生色染料四甲基聯(lián)苯胺參與反應(yīng)，呈現(xiàn)黃色產(chǎn)物，即通過酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）比色法定量評(píng)價(jià)DNA損傷水平的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。主要適用于各種小鼠細(xì)胞和組織裂解產(chǎn)物，以及體液樣品8-羥基脫氧鳥苷的定量分析。廣泛用于細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡、腫瘤等的研究。產(chǎn)品即到即用，反應(yīng)敏感，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。

技術(shù)背景

核酸氧化損傷（nucleotide oxidative damage），包括DNA和RNA損傷，是由于環(huán)境因子或細(xì)胞代謝影響，在逃避細(xì)胞防御機(jī)制的前提下，所產(chǎn)生的四種損傷之一：氧化、烷化（alkylation）、水解和堿基錯(cuò)配損傷等。而氧化損傷主要通過活性氧族（reactive oxygen species；ROS），包括超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）等的作用，使堿基羥基化和嘌呤環(huán)裂開，誘導(dǎo)鳥嘌呤（guanine；G）向胸腺嘧啶（thymine；T）的顛換（transversion），造成體細(xì)胞基因突變，影響細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡等，終導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，例如糖尿病、高血壓、中風(fēng)、癌癥、衰老等。其中核酸損傷產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine；8-OHdG）作為DNA損傷的分子標(biāo)志；8-羥基鳥苷（8-hydroxyguanosine）作為RNA損傷的分子標(biāo)志。8-羥基脫氧鳥苷是常見的DNA損傷產(chǎn)物，也是氧化應(yīng)急的生物標(biāo)志。通過使用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA），即基于單克隆抗8-羥基脫氧鳥苷抗體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合樣品中的8-羥基脫氧鳥苷，進(jìn)而使用辣根過氧化酶綴合二抗，由生色染料四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）參與反應(yīng)，呈現(xiàn)黃色產(chǎn)物，在分光光度儀下（450nm波長(zhǎng)），定量檢測(cè)8-羥基脫氧鳥苷的含量。

產(chǎn)品內(nèi)容

 標(biāo)記液（Reagent A）         毫升

 酶促液（Reagent B）    毫升

 清理液（Reagent C）    毫升

 底物液A（Reagent D）    毫升

 底物液B（Reagent E）    毫升

 終止液（Reagent F）    毫升

 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）    毫升

 抗體酶標(biāo)板 96孔

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；暫時(shí)不用，保存在－20℃冰箱里； 底物液B（Reagent E）易揮發(fā)，密閉瓶蓋，避免光照； 抗體酶標(biāo)板，密封干燥保存；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃或4℃冰箱里試劑盒中的試劑置于室溫下30分鐘均衡溫度。然后進(jìn)行下列操作：

• 標(biāo)準(zhǔn)樣品管濃度表：

• 標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品測(cè)定

• 準(zhǔn)備1個(gè) 抗體酶標(biāo)板：標(biāo)記好空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)樣品、待測(cè)樣品
• 加入50微升用戶自備的無離子水到空白對(duì)照孔里
• 分別加入xx微升 標(biāo)準(zhǔn)液G1至G6到對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品孔里
• 加入50微升待測(cè)樣品到待測(cè)樣品孔里
• 加入xx微升 標(biāo)記液（Reagent A）到待測(cè)樣品孔里
• 分別加入xx微升 酶促液（Reagent B）到標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品孔里
• 搖動(dòng)酶標(biāo)板，充分混勻
• 密封酶標(biāo)板
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育60分鐘（注意：培養(yǎng)箱保持濕潤(rùn)，避免干化）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 清理液（Reagent C）
• 室溫下孵育10秒
• 小心抽去清理液（注意：確保沒有液體殘留）
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟11至13四次
• 準(zhǔn)備1個(gè)1.5毫升離心管
• 分別加入等量的 底物液A（Reagent D）和 底物液B（Reagent E），混勻
• 加入xx微升上述配制的 底物工作液到標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品孔里
• 室溫下孵育15分鐘，避免光照（注意：可見藍(lán)色沉淀）
• 加入xx微升 終止液（Reagent F），混勻（注意：可見藍(lán)色變成黃色）
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀測(cè)讀：450nm波長(zhǎng)（注意：不宜超過30分鐘）
• 構(gòu)建8羥基脫氧鳥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光值（OD）；橫坐標(biāo)（X軸）為8-羥基脫氧鳥苷濃度（納克/毫升）
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)8-羥基脫氧鳥苷濃度（納摩爾/毫升）

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為96次操作量
• 本產(chǎn)品檢測(cè)敏感度達(dá)0.01納克/毫升
• 操作時(shí)，須戴手套
•  抗體酶標(biāo)板可以拆卸，用戶根據(jù)實(shí)際需求，選擇需要的孔板
• 系統(tǒng)操作時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定只需一次
• 孵育時(shí)，須避免光照
• 加樣時(shí)確保加入孔底，避免濺出和氣泡
• 注意加樣時(shí)，避免交叉污染，避免污染母液
• 建議使用濕度充分的培養(yǎng)箱
• 用戶根據(jù)實(shí)際用量，配制 底物工作液；須新鮮配制，即刻使用
• 建議染色完成后，即刻進(jìn)行比色分析
• 本公司提供系列核酸損傷檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感