準(zhǔn)備工作

（1）試管、試管架、滴管、吸管、小鼠固定架、玻璃瓶、玻璃皿、燒杯、橡皮頭、剪刀、鑷子、紗布、棉球、酒精燈、滴管、移液器、細(xì)胞計(jì)數(shù)器、生理鹽水、PBS、雙抗（青鏈霉素）、75%酒精、95%酒精、培養(yǎng)瓶（50ml，260ml）。

（2）BALB/C小鼠（4~5周齡，18~22g，雌雄不限）、胎牛血清（滅活）、DMEM-LG培養(yǎng)液（美國(guó)GIBCO）

（3）針頭與注射器：4.5號(hào)、7號(hào)針頭（沖小鼠股骨、脛骨和肱骨骨髓，制單細(xì)胞懸液）。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

（1）實(shí)驗(yàn)室消毒，隔離衣消毒，小鼠固定架消毒。配10%FBS培養(yǎng)液，加雙抗（內(nèi)含青霉素、鏈霉素各100μg/ml）。

（2）用75% 酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面，取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于超凈臺(tái)面，無(wú)菌室及超凈臺(tái)用紫外燈照射30~60 分鐘滅菌。

（3）開(kāi)始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。穿隔離衣，戴手套。用70% 酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才可開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。點(diǎn)燃酒精燈，安裝吸管帽。

實(shí)驗(yàn)步驟

（1）BALB/C純系小鼠脫臼處死后，75%乙醇浸泡5min后，在無(wú)菌操作臺(tái)上無(wú)菌條件下分離雙側(cè)股骨及脛骨，在含生理鹽水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周?chē)∪饨M織，剪去包括骺板在內(nèi)的兩側(cè)骺端，用10ml注射器（配4.5號(hào)針頭）抽取適量含10%FBS的*培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，將骨髓沖入培養(yǎng)瓶。依次用7號(hào)針頭和4.5號(hào)針頭（或依次過(guò)21、23、25號(hào)）反復(fù)吹打骨髓細(xì)胞懸液，制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液在1000rpm離心5min后收集細(xì)胞或進(jìn)行密度梯度離心。

（2）將單細(xì)胞懸液于1:2比例加到含1.082比重Percoll細(xì)胞分離液的離心管中，4℃條件下，經(jīng)500g密度梯度離心25min，小心收集離心液界面上乳白色云霧狀的單核細(xì)胞層，加入等量無(wú)血清培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液（PBS）充分洗滌（500g離心5min或180g離心10min）2次，去上清，用10%FBS的培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞（用0.83%氯化胺破碎紅細(xì)胞，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞）。注意：密度梯度離心力500g×30min組優(yōu)于800g×30min。本步驟可以省略。

附：人骨髓：抽取骨髓10-15ml（或正常人手術(shù)肋骨取骨髓3-5ml），每毫升骨髓加100u 肝素抗凝，充分混勻后，保存于4℃冰箱，24小時(shí)內(nèi)分離骨髓MNC。骨髓先加入等量 PBS或Hanks液（或培養(yǎng)液）混勻后，以1份淋巴細(xì)胞分離液上面加2份稀釋骨髓的比例，將稀釋骨髓緩慢加入ficoll液面上（密度1.077），水平離心機(jī)20℃條件下500g（2000r/min）離心25~30分鐘。從界面上取出的MNC用PBS液洗滌2~3次后，加適量培養(yǎng)液計(jì)數(shù)。

（3）數(shù)細(xì)胞數(shù)量，達(dá)到106~107/ml后即進(jìn)行原代培養(yǎng)，按5×106/ml濃度接種于50ml培養(yǎng)瓶中（1×106/cm2培養(yǎng)瓶），每瓶含5ml L-DMEM*培養(yǎng)液。在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和37℃條件下靜止培養(yǎng)，3d后換液去除非貼壁細(xì)胞，以后每3~4d半量換液1次，10~12d細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)傳代。

（4）傳代培養(yǎng)：傳代時(shí)先全部吸出培養(yǎng)液后，用無(wú)Ca2+ 、Mg2+PBS液洗滌二次，加入37℃預(yù)熱的0.25%（2.5g/L，0.25%）胰蛋白酶（含1mmol/L EDTA，即用1mmol/L-EDTA-Na2配制）消化1~2分鐘，吸去胰酶，以殘留的胰酶繼續(xù)消化，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞開(kāi)始皺縮時(shí)（細(xì)胞開(kāi)始變圓）加入*培養(yǎng)液（3ml左右）終止胰酶作用。吸管反復(fù)吹打后將細(xì)胞收集于15ml離心管中，1500r/min 離心10分鐘后棄上清，再用PBS液洗滌二次*洗去混有的胰蛋白酶。

將細(xì)胞再懸浮于培養(yǎng)液中，按2~5×105/ml再次接種傳代于新的培養(yǎng)瓶中。當(dāng)這些細(xì)胞生長(zhǎng)接近融合層時(shí)，即得到骨髓MSC。傳至3~5代的MSC按1×105cells/cm2密度接種于放置有蓋玻片的6孔板內(nèi)，以制備細(xì)胞爬片。

注：貼壁細(xì)胞的消化，應(yīng)掌握各類(lèi)型細(xì)胞不同的消化時(shí)間，避免過(guò)度消化，損傷細(xì)胞活力；或消化不足，不能充分解離成單細(xì)胞。如為長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)，每個(gè)月重新復(fù)蘇一支細(xì)胞，避免長(zhǎng)期傳代引起細(xì)胞特性變異。