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固體進入無菌室步驟：． 進入無菌室前應(yīng)打開紫光燈進行滅菌，時間為0。5—1小時。2． 關(guān)燈后0?5小時后放可進入。3． 進入更衣間更換衣服，佩帶、帽子、鞋套
實驗步驟：1， 進入無菌室后，先把酒精燈點燃，然后在用酒精棉進行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脫脂棉中制成）2， 準(zhǔn)備雙料管3根，單料管6根，培養(yǎng)皿7個。3， 直接從原液中吸取10ml放入雙料管，（3根每根各10ml）4， 再吸取原液1ml放入單料管中（3根每根各1ml）5， 再吸取原液1ml放入培養(yǎng)皿中（2個培養(yǎng)皿各1ml）6， 再吸取原液1ml放入鹽水管中制成－1梯度的樣液7， 更換一根吸管，從－1梯度的樣液吸取1ml樣液放入單料管中（3根每根各1ml）8， 再吸?。?梯度樣液1ml放入培養(yǎng)皿中（2個培養(yǎng)皿各1ml）9， 再把每個培養(yǎng)皿中到入營養(yǎng)瓊脂平鋪底部搖允（注另作3個培養(yǎng)皿：空氣空白，把培養(yǎng)皿打開十分鐘倒入營養(yǎng)瓊脂平鋪底部搖勻。瓊脂空白，把培養(yǎng)皿中倒入營養(yǎng)瓊脂平鋪底部搖勻。鹽水空白，吸1ml生理鹽水放入培養(yǎng)皿中，倒入營養(yǎng)瓊脂平鋪底部搖勻。）10， 把全部作好的放入培養(yǎng)箱中，溫度36C＋－1×C，大腸24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培養(yǎng)皿中的瓊脂凝固后反轉(zhuǎn)過來放入培養(yǎng)箱中。11， 梯度：－1梯度為1ml原液加入9ml生理鹽水配成－2梯度為1ml－1梯度樣液加入9ml生理鹽水配成－3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一樣。12， 如果大腸初發(fā)酵產(chǎn)生氣泡，用接種筆沾一個產(chǎn)氣的液在伊紅美蘭平板上畫之字形然后放入培養(yǎng)箱中36C，24H＋－2H 。（接種筆在每次使用前必須在酒精燈上消毒。所畫之形不能劃破伊紅美蘭瓊脂表面）。13， 取出后在用接種筆在伊紅美蘭平板之字形上挑菌，放入乳糖復(fù)發(fā)酵管中 ，然后再培養(yǎng)36C＋－1C，24H＋＋－2H。。14， 再在伊紅美蘭平板之字形上挑菌，放到載玻片上作鏡檢。（方法見標(biāo)準(zhǔn)）。15， 只有鏡檢成紫紅色和乳糖復(fù)發(fā)酵管產(chǎn)氣同時成立的情況下，才能斷定這根管是不合格。。16， 清洗消毒這根試管前必須進行消毒霉菌，121C，0。5小時同時不能放氣。
水中大腸菌群的檢測實驗材料和用具
復(fù)紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基(遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基)、乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基、乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、三倍濃乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、伊紅美藍培養(yǎng)基(EMB 培養(yǎng)基)。
微孔濾膜(孔徑0.45?m)、濾器(容量500mL)、抽氣設(shè)備、鑷子、發(fā)酵用試管、杜氏小管、培養(yǎng)皿、刻度吸管或移液管、接種環(huán)、酒精燈。
操作步驟
(一)水樣的采集：1．自來水 將自來水龍頭用火焰燒灼3min滅菌，再擰開水龍頭流水5min， 以排除管道內(nèi)積存的死水，隨后用已滅菌的三角瓶接取水樣，以供檢測。2．池水、河水或湖水 將無菌的帶玻塞的小口瓶浸入距水面10～15cm深的水層中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中裝滿后，蓋好瓶塞，取出后立即進行檢測，或臨時存于冰箱，但不能超過24h。
(二)濾膜法檢測大腸菌群：l．用無菌鑷子將一無菌濾膜置于濾器的承受器當(dāng)中，將過濾杯裝于濾膜承受器上，旋緊，使接口處能密封，將真空泵與濾器下部的抽氣口連接(圖26-1)。2．加水樣100mL于濾杯中，啟動抽真空系統(tǒng)，使水通過濾膜流到下部，水中的菌細(xì)胞被截留在濾膜上。水樣用量可適當(dāng)增減使獲得菌落適量。3．用無菌鑷子小心將截留有細(xì)菌的濾膜取出，平移貼于復(fù)紅亞硫酸鈉固體培養(yǎng)基上(注意無菌操作，濾膜與培養(yǎng)基間貼緊，無氣泡)，37℃培養(yǎng)16～l8h。挑選深紅色或紫紅色、帶有或不帶金屬光澤的菌落，或淡紅色、中心色較深的菌落進行涂片和革蘭氏染色觀察。4．經(jīng)染色證實為革蘭氏陰性無芽孢桿菌者，再接種在乳糖蛋白胨半固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)6～8h后觀察，產(chǎn)氣者證實為大腸菌群陽性。培養(yǎng)中應(yīng)及時觀察，時間過長則氣泡可能消失。
5．結(jié)果計算：水樣中總大腸菌群數(shù)/個?L-1=（濾膜生長的菌落數(shù)/過濾水樣量/mL）×100（濾膜上菌落數(shù)以20～60個/片較為適宜）
多管發(fā)酵法檢測大腸菌群
1．取5支裝有3倍濃乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的初發(fā)酵管，每管分別加入水樣10mL。另取5支裝有乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的初發(fā)酵管，每管分別加入水樣lmL。再取5支裝有乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的初發(fā)酵管，每管分別加入按1：10稀釋的水樣lmL（即相當(dāng)于原水樣0.1mL），均貼好標(biāo)簽。此即為15管法，接種待測水樣量共計55.5mL。各管搖勻后在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。
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