說(shuō)起引物，大家都再熟悉不過(guò)了。引物，在核苷酸聚合作用的起始時(shí)，可以刺激合成另一種大分子，并與反應(yīng)物以共價(jià)鍵形式連接的序列。在核酸化學(xué)中，引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)，核酸聚合酶可由其3′端開(kāi)始合成新的核酸鏈。無(wú)論是做普通PCR還是熒光定量PCR，設(shè)計(jì)合適的引物是非常關(guān)鍵的一步。

普通PCR和熒光定量PCR的檢測(cè)方式具有較大的差別。熒光定量PCR實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與DNA結(jié)合的熒光染料激發(fā)的熒光，普通PCR通過(guò)檢測(cè)插入DNA中核酸染料的量來(lái)測(cè)定PCR最終產(chǎn)物量。熒光定量PCR可以通過(guò)擴(kuò)增曲線(xiàn)進(jìn)行精確定量，普通PCR則是通過(guò)電泳的方式進(jìn)行定性分析。那么在普通PCR和熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)方面，有什么相同點(diǎn)和不同點(diǎn)呢？今天遠(yuǎn)慕生物就給大家匯總一下。

相同處：
序列的查找是一致的。
序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段。
選取合適的擴(kuò)增片段大小。
避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)。
避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)。
Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%。
引物之間的Tm相差避免超過(guò)2℃。
引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基。

不同處：
熒光定量PCR 引物
PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度：要求在300bp以?xún)?nèi)，一般首/選80-150bp之間。
引物特異性：對(duì)引物要求高，盡量減少引物二聚體的產(chǎn)生，熔解曲線(xiàn)要求單一產(chǎn)物。
擴(kuò)增效率：熒光定量 PCR的目的是進(jìn)行定量或者相對(duì)定量，擴(kuò)增效率應(yīng)在90%—110%之間。
多對(duì)目的基因同時(shí)擴(kuò)增，文獻(xiàn)上查來(lái)的引物條件會(huì)不同，需要設(shè)計(jì)盡可能條件一致的引物。
目的基因含量比較低時(shí)，需要設(shè)計(jì)靈敏度比較高的引物。

普通PCR 引物
普通PCR的擴(kuò)增長(zhǎng)度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求不同，一般是從150bp到幾千bp不等。
相對(duì)于熒光定量PCR，普通PCR對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)要求較低。
對(duì)擴(kuò)增效率要求不高。
可以選用梯度PCR儀，選擇不同退火溫度，對(duì)引物退火溫度要求不需要一致。