（1）試劑：MatrigengeL Matrix、小鼠膽管類器官培養(yǎng)試劑盒、類器官消化液、潤洗液、基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

（2）耗材：48孔細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管（規(guī)格為1.5mL）、移液器（規(guī)格為10μL、200μL、1000μL和5000μL）、無菌吸頭（規(guī)格為10μL、200μL和1000μL）、40μm細(xì)胞過濾器。

（1）MatrigengeL Matrix 4℃化凍

（2）小鼠膽管類器官培養(yǎng)基的制備：將200μL Mouse Liver Ductal Organoid Supplement B (50x)，40μL Mouse Liver Ductal Organoid Supplement C(250x)加至9.76mL Mouse Liver Ductal Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10mL小鼠膽管類器官培養(yǎng)基，室溫平衡，可在2-8°C儲(chǔ)存，建議在兩周內(nèi)使用。

以下操作吹打細(xì)胞的吸頭均需用潤洗液潤洗后使用：

（1）小鼠膽管類器官收集：保留原有培養(yǎng)液，用移液管吸頭輕輕刮下吹打細(xì)胞外基質(zhì)和小鼠膽管類器官混合物，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，吹打5~10次，使小鼠膽管類器官和細(xì)胞外基質(zhì)分離，300g離心3分鐘。

（2）小鼠膽管類器官消化：離心后，去除上清液，分別加入200μL類器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中消化。

（3）小鼠膽管類器官終止消化：類器官消化時(shí)間5分鐘，吹打混勻，加入1mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹打混勻以終止消化反應(yīng)，300g離心3分鐘。

（4）細(xì)胞過濾：加入1mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，用40μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，收集濾液至新的離心管中，300g離心3分鐘。

（5）小鼠膽管類器官清洗：離心后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗1次收集至同一個(gè)離心管中，離心以去除殘留的消化液。

（6）細(xì)胞計(jì)數(shù)：用1mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取18μL細(xì)胞懸液與2μL臺(tái)盼藍(lán)混勻，取10μL混合液加至血球計(jì)數(shù)板中，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù),300g離心3分鐘，棄上清。

（7）基質(zhì)膠3D包裹：根據(jù)密度加入適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取5 μL細(xì)胞懸液至新的離心管中，每組分別與18μL不同的細(xì)胞外基質(zhì)冰上混勻（注意，混勻吹打的動(dòng)作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。

（8）種板培養(yǎng)：用移液器吸取10μL細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞的混合液移至培養(yǎng)板孔中，混合懸液須點(diǎn)在培養(yǎng)孔底部中央位置，其鋪開后不可接觸培養(yǎng)孔側(cè)壁，平行2孔。將培養(yǎng)板放入37℃，在5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20分鐘，待細(xì)胞外基質(zhì)凝固至不再流動(dòng)后，沿孔壁緩緩加入250μL培養(yǎng)基。

（9）持續(xù)培養(yǎng)：將細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每1天于倒置顯微鏡下觀察小鼠膽管類器官的生長狀態(tài)，于倒置顯微鏡下拍照，記錄多個(gè)視野中類器官的形態(tài)和分布。

模基基質(zhì)膠與Brand C基質(zhì)膠均有良好的培養(yǎng)效果，兩組實(shí)驗(yàn)?zāi)懝茴惼鞴倬鶡o明顯貼壁現(xiàn)象，其中20224105CWD的培養(yǎng)效果會(huì)好一些。

?；锘|(zhì)膠經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)檢驗(yàn)證，具備安全性高、濃度多樣性、批次穩(wěn)定性好、低內(nèi)毒素、無污染。在購買模基產(chǎn)品時(shí)，根據(jù)用戶個(gè)性化的需求對用戶進(jìn)行最佳產(chǎn)品、貨號(hào)的推薦。

1.Cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver（science）