線粒體是細(xì)胞的動(dòng)力源，因?yàn)樗鼈円匀姿嵯佘眨?span style="font-family: Calibri;">ATP）的形式產(chǎn)生了大部分的能量供應(yīng)。線粒體是一種雙膜細(xì)胞器：一種外膜和一種折疊的內(nèi)膜，稱為嵴。分離的線粒體是研究線粒體呼吸、呼吸復(fù)合體組裝、細(xì)胞凋亡、mtDNA和mtRNA以及線粒體蛋白分析的首-選樣本。

Biogradetech線粒體提取試劑盒為分離完整的線粒體提供了兩種選擇。第一種選擇是利用一種基于試劑的方法，允許平行處理多個(gè)樣品。第二種選擇使用傳統(tǒng)的跳躍均質(zhì)化，這提供了更好的線粒體產(chǎn)量。

微光應(yīng)用程序：

從組織和培養(yǎng)細(xì)胞中分離出高純度、完整和有功能的線粒體。

線粒體呼吸研究，復(fù)合物的組裝，細(xì)胞凋亡，mtDNA和mtRNA，以及蛋白質(zhì)譜分析。

西方印跡和ELISA。

線粒體提取樣品類型：

哺乳動(dòng)物組織。

培養(yǎng)細(xì)胞。

儲(chǔ)存和處理：

存儲(chǔ)工具包在-20°C，避光。在使用前解凍試劑。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)讀取整個(gè)方案。

艾美捷 線粒體提取試劑盒 （D-AKE4003-50T）分離方案：

1.樣品制備：

a. 培養(yǎng)細(xì)胞：小顆粒2 x107細(xì)胞在600 xg下離心10 min。小心地去除并丟棄上清液。

b. 組織：分離出感興趣的組織。將組織（50-200 mg）浸泡在1毫升冰冷的線粒體分離緩沖液中，并沖洗兩次以除去血液。用1毫升冰冷的線粒體分離緩沖液，用剪刀將放在冰上的組織切成小塊。將切碎的組織在桌面離心機(jī)中以10000xg旋轉(zhuǎn)2 min。棄用緩沖液，換上1 ml新鮮冰冷的線粒體分離緩沖液。

2.線粒體分離的程序：

a.使用Dounce均質(zhì)器分離線粒體：在線粒體分離緩沖液中使用預(yù)冷玻璃均質(zhì)器對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行均質(zhì)化。在冰上敲擊樣品3-4次。組織或細(xì)胞與線粒體分離緩沖液之間的最佳比例范圍為1：5-1：10（w/v）。將勻漿轉(zhuǎn)移到試管中，以600 x g離心10 min。在4°C。將上清液收集于單管中，7000xg離心10 min。在4°C。棄出上清液，再次用線粒體分離緩沖液清洗顆粒。取出上清液，在存儲(chǔ)緩沖液中重懸線粒體。確定蛋白質(zhì)濃度，并使用存儲(chǔ)緩沖液調(diào)整到所需的蛋白質(zhì)濃度。

b.基于試劑分離線粒體方法：在細(xì)胞顆粒中加入1 ml線粒體分離緩沖液，渦旋5秒，冰孵育2 min。加入10µl試劑A，渦旋5秒。冰敷5 min。同時(shí)每分鐘旋轉(zhuǎn)一次。持續(xù)5秒。600 x g離心機(jī)，離心機(jī)為10 min。在4°C。將上清液收集于單管中，7000xg離心10 min。在4°C。棄出上清液，用線粒體分離緩沖液清洗顆粒。取出上清液，在存儲(chǔ)緩沖液中重懸線粒體。確定蛋白質(zhì)濃度，并使用存儲(chǔ)緩沖液調(diào)整到所需的蛋白質(zhì)濃度。

記下

a.為了避免蛋白質(zhì)降解，建議您在線粒體分離緩沖液中加入蛋白酶抑制劑雞尾酒。

b.均質(zhì)化的中風(fēng)次數(shù)將取決于細(xì)胞或組織類型的不同。

c.對(duì)于細(xì)胞，為了檢查細(xì)胞裂解效率，將5µl的細(xì)胞裂解液涂成載玻片，加入蓋層，在顯微鏡下觀察。對(duì)于組織，進(jìn)行足夠的中風(fēng)以獲得均勻的懸浮液而不溶解細(xì)胞。通常對(duì)于軟組織，10,15次中風(fēng)和對(duì)于硬組織，5-10次中風(fēng)就足夠了。

3.基于應(yīng)用程序的存儲(chǔ)條件：對(duì)于完整的線粒體，在存儲(chǔ)緩沖液中重懸。保持冰立即使用或在液氮中快速冷凍，儲(chǔ)存在-80°C以備將來使用。為了裝載凝膠的目的，線粒體可以存儲(chǔ)在適當(dāng)?shù)臉悠?span style="font-family: Calibri;">PAGE緩沖液中（未提供）。

圖：線粒體完整性檢測(cè)：按照上述方案，從小鼠肝臟中純化出線粒體（100µg）。用JC-1染料檢測(cè)純化后的線粒體的完整性，該染料檢測(cè)線粒體內(nèi)膜的電化學(xué)化質(zhì)子梯度（ΔΨ）。將純化后的線粒體放在冰上解凍，并與JC-1染料（1µg/ml）孵育15 min。在37°C。完整的純化線粒體顯示JC-1染料的聚集，其信號(hào)可以在Ex/Em = 530/590 nm處測(cè)量。用抗-霉-素A（100µM）處理可消散線粒體膜電位，導(dǎo)致熒光信號(hào)降低。

*僅供研究使用！不能用在人類身上