免疫酶細(xì)胞化學(xué)酶標(biāo)抗體法
 
    酶標(biāo)抗體的染色可分為直接法和間接法。直接法是將酶直接標(biāo)記在每一種抗體上，間接法是將酶標(biāo)記在第2抗體上，檢測組織細(xì)胞內(nèi)的特定抗原物質(zhì)。間接法所用的第l抗體是對組織細(xì)胞內(nèi)某種抗原的特異性抗體(80％～90％的抗血清系由家兔制得，而絕大多數(shù)單克隆抗體系由小鼠制備)；第2抗體則為第1抗體[家兔和(或)小鼠的IgG]的抗體。所以，只要不同的第1抗體均來自同一種屬，同一標(biāo)記的第2抗體就能用來顯示不同特異性抗原的存在，這樣可避免直接法中標(biāo)記每一種第1抗體的麻煩，并且提高了敏感度。目前的ICC染色中，以間接法應(yīng)用zui廣，在此著重介紹間接法的染色程序。
    (1)切片準(zhǔn)備：①石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，再經(jīng)不同濃度的乙醇溶液處理。②固定與未固定的新鮮組織冷凍切片，室溫干燥2h以上。
    (2)未固定的新鮮組織切片，經(jīng)丙酮固定20—30min后，用蛋白酶處理，去除固定劑交聯(lián)造成的空間遮蔽，在室溫下風(fēng)干(15—30min)；已固定的組織冷凍切片及石蠟切片，根據(jù)需要可進(jìn)行組織抗原的激活。
    (3)用蠟筆沿切片周圍勾劃一道屏障，以避免孵育液流失及孵育過程中切片干燥，同時也能節(jié)省抗體用量，保持切片與抗體的充分接觸，風(fēng)干。
    (4)切片經(jīng)PBS或其他緩沖液漂洗3次，每次2min，溶解除去冷凍切片上的包埋劑。但應(yīng)用ALP標(biāo)記抗體時，禁用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，因后者可使ALP失活。
    (5)根據(jù)需要，用甲醇十0．3％H2O2處理切片15—30min(室溫)，封閉內(nèi)源性過氧化酶的活性。應(yīng)用ALP標(biāo)記抗體時此步驟可省略。
    (6)PBg漂洗2次，每次2min，移至0，05％Tween-20／PBS(或0．22％一1％TritonX-lOO)中5min(室溫)。Tween-20為一種表面活性劑，除具有清潔作用外，還可增加組織的通透性，有利于組織細(xì)胞內(nèi)抗原的
顯示。
    (7)0．1％一1％BSA濕盒內(nèi)孵育15～25min(室溫)后，輕輕棄去孵育液(不沖洗)；以阻斷組織與抗體的非特異性結(jié)合，降低背景染色。
    (8)滴加含0．2％BSA／0．05％NaN3／PBS稀釋的第1抗體(抗體用量：每張切片一般為50～80P1)，濕盒內(nèi)孵育1～2h(20—25℃)。
    (9)PBS充分沖洗(3次X 2rain)，以去除切片上非特異吸附的抗體。應(yīng)用不同的第1抗體或同時進(jìn)行對照標(biāo)本染色時，需分別沖洗，以防相互污染。
    (10)滴加含0．2％BSA／PBS稀釋的HRP酶標(biāo)記的第2抗體，20～25℃濕盒內(nèi)孵育45—60min。
    (11)PBS漂洗(3次X2min)。
    (12)未固定或固定較弱的冷凍切片，此處可輕微固定。首先將切片從PBS移至Tris—HCl緩沖液(TBS)中，去除PBS，以防其中的磷酸與后面使用的固定液中的CaCl2形成磷酸鈣而沉淀，然后用固定液固定5min
(室溫)此時輕微固定，既不影響抗原抗體結(jié)合，又較有利于保存第1抗體孵育前的組織抗原，尤其適用于單克隆抗體的ICC染色。
    (13)呈色：HRP標(biāo)記抗體的呈色液為0．01％一0．1％H202，0．01％一0．05％DAB和0．05—0．1mol／LWris—HCI(pH7．4)。切片經(jīng)PBS或Tris—HCl液漂洗后，置上述呈色液內(nèi)10～15min(室溫，暗處)，亦可在光學(xué)顯微鏡下控制顯色速度，終產(chǎn)物為棕褐色沉淀。
    (14)將切片置流水中，終止呈色反應(yīng)。
    (15)DAB呈色的標(biāo)本可用系列乙醇脫水、Hemo-De透明、DPX封固。其他物質(zhì)呈色的標(biāo)本在有機溶劑中沉淀物易溶解、褪色，用水溶性封固劑(如明膠甘油等)封固可使切片保存時間更長。
    (16)顯微鏡檢查，觀察記錄結(jié)果。