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中級(jí)會(huì)員 | 第15年
PCR應(yīng)用中存在的問(wèn)題2023/08/10
開展PCR應(yīng)具有一定的條件。需要一個(gè)正規(guī)的pCR實(shí)驗(yàn)室,采集標(biāo)本、核酸提取、擴(kuò)增及產(chǎn)物分析應(yīng)在不同的房間進(jìn)行;需有嚴(yán)密的防污染措施、假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的質(zhì)控等。實(shí)驗(yàn)者應(yīng)具有一定的分子生物學(xué)理論知識(shí)及實(shí)驗(yàn)技能,能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)和糾正實(shí)驗(yàn)中的問(wèn)題。目前,我國(guó)在PCR應(yīng)用中尤其是在臨床診斷中存在問(wèn)題較多,主要表現(xiàn)為:PCR試劑的考核、審查工作薄弱,許多單位實(shí)驗(yàn)條件不符合要求,部分操作人員的理論和實(shí)驗(yàn)知識(shí)水平較低。PCR的應(yīng)用范圍過(guò)寬等,因此造成PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性差,出現(xiàn)較多的假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果。一、假
PCR技術(shù)基本原理2023/08/10
1.PCR技術(shù)基本原理PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqD
電泳儀常見問(wèn)題處理方法2023/08/09
注意事項(xiàng)1、電泳中使用的溴化乙錠(EB)為中度毒性、強(qiáng)致癌性物質(zhì),務(wù)必小心,勿沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門電泳區(qū)域操作,戴一次性手套,并及時(shí)更換。2、預(yù)先加入EB時(shí)可能使DNA的運(yùn)動(dòng)速度下降15%左右,且不同構(gòu)型的DNA的影響程度不同。所以為取得較真實(shí)的電泳結(jié)果可以在電泳結(jié)束后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。EB在光照下易降解,若凝膠放置一段時(shí)間后才觀察,即使原來(lái)膠內(nèi)或樣品已加EB,建議選擇EB溶液浸泡染色。3、加樣進(jìn)膠時(shí)不要形成氣泡,需在凝膠液未凝固之前及時(shí)**
瓊脂糖凝膠電泳的原理介紹2023/08/09
實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物,以瓊脂凝膠作為支持物,利用DNA分子在電場(chǎng)中時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng),達(dá)到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電,在電場(chǎng)中由陰極向陽(yáng)極運(yùn)動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下,忽略DNA分子攜帶的電荷,DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng),即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子量成反比。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同。如環(huán)形DNA分子樣品,其中有三種構(gòu)型的分子:超螺旋分子(cccDNA)、開環(huán)分
做電泳實(shí)驗(yàn)常見條帶問(wèn)題分析詳解2023/08/09
一、微笑形區(qū)帶(兩邊翹起,中間凹下):形成原因:主要是由凝膠中間部分凝固不均勻引起的,多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。處理辦法:待其充分凝固再做實(shí)驗(yàn)。二、皺眉形區(qū)帶(兩邊向下,中間鼓起):形成原因:主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中,一般是由兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈引起的。處理辦法:可在兩板之間加入適量緩沖液,以排除氣泡。三、區(qū)帶拖尾:形成原因:主要是由樣品溶解效果不佳或分離膠濃度過(guò)大引起的。處理辦法:加樣前離心;選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液,加適量樣品促溶劑;電泳緩沖液放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng),重新配制;降低凝膠濃度。四
夾芯式垂直電泳槽使用方法2023/08/09
一、組成部件(一)裝有鉑金絲的貯液槽一對(duì),配有冷卻裝置及電泳緩沖液流出口。(二)凹型橡膠框,配有玻璃板,可分別制作厚度為lmm、1.5mm的凝膠板,操作時(shí)根據(jù)需要選擇適當(dāng)厚度的玻璃板及梳子配套使用。(三)樣品孔模具(梳子)用于電泳加樣。(四)固定貯液槽的螺絲桿及螺母4對(duì),28D、30型為5對(duì)。(五)橡膠管五根。兩根長(zhǎng)的用于連接冷卻水的出入口;中等長(zhǎng)度的兩根用于連接電極緩;中液的流出口;*短的一根用于連接貯液槽間的冷卻水。(六)導(dǎo)線1付。●二、使用方法(一)清洗部件上述部件組裝前要徹清洗干凈。尤其
講解電泳儀的使用方法2023/08/09
電泳儀:電泳技術(shù)是分子生物學(xué)研究的重要分析手段。電泳一般分為自由界面電泳和區(qū)帶電泳兩大類,自由界面電泳不需支持物,如等電聚焦電泳、等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等,這類電泳目前已很少使用。而區(qū)帶電泳則需用各種類型的物質(zhì)作為支持物,常用的支持物有濾紙、醋酸纖維薄膜、非凝膠性支持物、凝膠性支持物及硅膠-G薄層等,分子生物學(xué)領(lǐng)域中*常用的是瓊脂糖凝膠電泳。所謂電泳,是指帶電粒子在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng),不同物質(zhì)由于所帶電荷及分子量的不同,因此在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)速度不同,根據(jù)這一特征,應(yīng)用電泳法便可以對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行定
日本奧林巴斯CKX53的使用說(shuō)明2023/08/06
奧林巴斯CKX53的使用說(shuō)明及注意事項(xiàng)奧林巴斯CKX53為倒立的低倍普及型顯微鏡,用于細(xì)胞培養(yǎng)觀察。本產(chǎn)品不能用于其設(shè)計(jì)用途以外的任何其他目的。照明是汞燈光源U-RFL-T為顯微鏡提供光源。用戶在使用過(guò)程中如果未按照規(guī)定的方式使用該設(shè)備,可能會(huì)危及用戶的安全。此外,還可能損壞本產(chǎn)品。請(qǐng)務(wù)必按照使用說(shuō)明使用本產(chǎn)品?!髯⒁猓悍乐垢腥救绻^察具有潛在感染性的標(biāo)本,請(qǐng)按照以下要求操作,以防止感染。?使用防護(hù)用具,比如手套等。請(qǐng)使用防護(hù)用具,比如手套等,以防皮膚直接接觸到標(biāo)本。保養(yǎng)可能已接觸標(biāo)本的產(chǎn)品時(shí),
Veritipro PCR儀售后維修與使用操作步驟2023/08/06
ABIVeritiProPCR儀售后維修與使用操作步驟:BIVeritiProPCR儀操作步驟1、打開PCR儀的熱蓋,插入0.2ml的樣品管。蓋好熱蓋。2、打開PCR儀的電源,儀器程序開始初始化,需等待幾分鐘。3、初始化完成后,顯示主菜單:4、點(diǎn)“Browse/NewMethods”,進(jìn)入PCR程序列表:5、可以直接點(diǎn)一個(gè)PCR程序,選擇“StartRun”運(yùn)行;點(diǎn)右邊的符號(hào),可以選擇不同的文件夾。如要新建一個(gè)PCR程序,點(diǎn)“New”,出現(xiàn)PCR程序:6、添加一段程序:點(diǎn)中上方的“Stage”位
PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件2023/08/06
PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件--------------------------------------------------------------------------------標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系:10×擴(kuò)增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200umol/L引物各10~100pmol模板DNA0.1~2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至100ulPCR反應(yīng)五要素:參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物:引物是PCR特異
PCR儀的種類講解2023/08/06
【PCR儀的種類】分類總是五花八門,總體來(lái)說(shuō)可以分為PCR擴(kuò)增儀和實(shí)時(shí)熒光PCR儀兩大類,有人也把它們稱為半自動(dòng)和全自動(dòng),或者定性和定量,都是比較不準(zhǔn)確的稱呼。PCR最重要的就是個(gè)升降溫過(guò)程,最初的水浴鍋式PCR,就是三個(gè)水浴箱,一個(gè)機(jī)械臂,定時(shí)抓出反應(yīng)槽轉(zhuǎn)換水浴鍋。這種東東體積大,迅速慢,但其實(shí)結(jié)果并不比以后的PCR儀差,我現(xiàn)在都很欣賞。后來(lái)有人利用致冷和加熱做成了,固定位置升降溫的PCR擴(kuò)增儀。后來(lái)隨著定量技術(shù)的發(fā)展,有公司將擴(kuò)增儀和檢測(cè)做成一體,也就成了現(xiàn)在所謂的全自動(dòng)(或定量)PCR儀。
降落PCR的原理及常見問(wèn)題講解2023/08/06
提問(wèn):降落PCR(TouchdownPCR)的原理?回答:TouchdownPCR是指每隔一個(gè)循環(huán)降低1°C反應(yīng)退火溫度,直至達(dá)到“Touchdown”退火溫度,然后以此退火溫度進(jìn)行10個(gè)左右的循環(huán)。該方法最初出現(xiàn)是為了避開確定最佳退火溫度而進(jìn)行的復(fù)雜的反應(yīng)優(yōu)化過(guò)程。正確和非正確退火溫度之間的任何差異將造成每個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物量的兩倍差異(每攝氏度造成4倍差異)。因此相對(duì)于非正確產(chǎn)物,正確的產(chǎn)物可以得到富集該方法的另一個(gè)應(yīng)用是在確定已知序列肽的DNA序列。具體過(guò)程如下:使用兩套與已知序列肽兩末端可
抽真空操作方法原理2023/07/28
一、為什么要抽真空。三洋松下制冰機(jī)制冷系統(tǒng)是利用某種制冷劑和潤(rùn)滑油在系統(tǒng)內(nèi)的反復(fù)循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能的。當(dāng)制冷設(shè)備安裝與維修時(shí),必然有空氣進(jìn)入系統(tǒng)??諝庥醒鯕?、氮?dú)庖约八魵?,所有這些對(duì)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)都是有害的。二、什么是抽真空。用真空泵從系統(tǒng)中排除空氣和其他不凝性氣體稱為系統(tǒng)的“抽真空”,系統(tǒng)中水蒸氣的排除稱為“脫水”。在采暖、通風(fēng)、空調(diào)和制冷行業(yè),排除空氣與水蒸氣的過(guò)程稱為“抽真空”:抽氣+脫水=抽真空這些氣體會(huì)引起兩個(gè)問(wèn)題:空氣中所含的氮?dú)夥Q為不凝性氣體,在冷凝器中不能冷凝,甚至像液體一樣流動(dòng);相反
簡(jiǎn)單介紹電泳槽的使用方法2023/07/28
電泳槽的使用1、將凝膠密封條框放在平板上,然后將凹型玻璃板與平板玻璃重疊(圖1)。2、將兩塊玻璃立起來(lái)使其底端接觸桌面,用手將兩塊玻璃板夾住放入電泳槽內(nèi),然后插入斜楔板(直面對(duì)玻璃,斜面對(duì)槽)到適中程度,即可灌膠(圖2,圖3)?!?、凝膠凝結(jié)后,輕輕取下梳子(圖4)。4、用手夾住兩塊玻璃板,上提斜楔板,使其松開,然后取下玻璃膠室去掉凝膠密封框,注意在上述過(guò)程中手始終給玻璃膠室一個(gè)壓緊力,再將玻璃膠室凹面朝里置入電泳槽,插入斜楔板,將緩沖液加至內(nèi)槽玻璃凹口以上,外槽緩沖液加到距玻璃上沿3mm處即可
蛋白質(zhì)雙向電泳注意點(diǎn)2023/07/28
蛋白質(zhì)的雙向電泳的第一向?yàn)榈入娋劢梗↖soelectrofocusing,IEF),根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離;第二向?yàn)镾DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),按亞基分子量大小進(jìn)行分離。經(jīng)過(guò)電荷和分子量?jī)纱畏蛛x后,可以得到蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)和分子量信息。注意事項(xiàng):1.一向聚焦與二向電泳之間需要平衡,時(shí)間視蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定,一般為10min,最多不超過(guò)15min。2.過(guò)量的上樣量會(huì)引起雙向圖形畸形,特別在一向聚焦時(shí),當(dāng)樣品濃度超過(guò)5mg時(shí),則蛋白質(zhì)凝聚和沉淀,使二向時(shí)產(chǎn)生水平和垂直條紋
跑電泳注意事項(xiàng)2023/07/28
影響電泳分離的主要因素:1.待分離生物大分子的性質(zhì):待分離生物大分子所帶的電荷、分子大小和性質(zhì)都會(huì)對(duì)電泳有明顯影響。一般來(lái)說(shuō),子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形,則其電泳遷移速度越快。2.緩沖液的性質(zhì):緩沖液的pH值會(huì)影響待分離生物大分子的解離程度,從而對(duì)其帶電性質(zhì)產(chǎn)生影響,溶液pH值距離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn),其所帶凈電荷量就越大,電泳的速度也就越大,尤其對(duì)于蛋白質(zhì)等兩性分子,緩沖液pH還會(huì)影響到其電泳方向,當(dāng)緩沖液pH大于蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn),蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷,其電泳的方向是指向正極。為了保持
電泳槽的使用方法2023/07/28
電泳技術(shù)是分子生物學(xué)研究的重要分析手段。電泳一般分為自由界面電泳和區(qū)帶電泳兩大類,自由界面電泳不需支持物,如等電聚焦電泳、等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等,這類電泳目前已很少使用。而區(qū)帶電泳則需用各種類型的物質(zhì)作為支持物,常用的支持物有濾紙、醋酸纖維薄膜、非凝膠性支持物、凝膠性支持物及硅膠-G薄層等,分子生物學(xué)領(lǐng)域中常用的是瓊脂糖凝膠電泳。所謂電泳,是指帶電粒子在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng),不同物質(zhì)由于所帶電荷及分子量的不同,因此在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)速度不同,根據(jù)這一特征,應(yīng)用電泳法便可以對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分
實(shí)驗(yàn)室超純水器操作規(guī)范2023/07/21
不可否認(rèn),實(shí)驗(yàn)室超純水器的使用已日益頻繁,而且對(duì)于業(yè)內(nèi)人士來(lái)說(shuō),它的使用方法和操作規(guī)程已經(jīng)是輕車熟路了,但是我們?cè)谑褂玫倪^(guò)程中也有一些小小的操作細(xì)節(jié)被大家所忽略。雖說(shuō)短時(shí)間內(nèi)可能沒(méi)什么問(wèn)題,但是長(zhǎng)久來(lái)說(shuō)是非常嚴(yán)重的。今天小編就和大家說(shuō)說(shuō)實(shí)驗(yàn)室超純器你沒(méi)注意到的那些細(xì)節(jié)吧!1、未排空設(shè)備中的水我們都知道,細(xì)菌可以在水處理系統(tǒng)中快速生長(zhǎng)。而純水系統(tǒng)的增長(zhǎng)量,取決于進(jìn)入系統(tǒng)的細(xì)菌數(shù)量,對(duì)于安裝超純水器的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō),如果不注意在下班后、周末休息或長(zhǎng)時(shí)間放假時(shí),未使用的水會(huì)在設(shè)備中停滯不前,這樣就會(huì)導(dǎo)致細(xì)
快速選型實(shí)驗(yàn)室超純水設(shè)備2023/07/21
近日來(lái),各大高校及科研院所都在如火如荼地采購(gòu)儀器設(shè)備。在這場(chǎng)熱潮中,如何快速選型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)?我們一起來(lái)了解一下。首先,國(guó)產(chǎn)超純水機(jī)較進(jìn)口品牌而言更具有性價(jià)比,無(wú)論是產(chǎn)水水質(zhì),還是性能參數(shù)都不亞于進(jìn)口的,在售后和后期耗材的維護(hù)上優(yōu)勢(shì)更明顯。大可放心選擇國(guó)產(chǎn)品牌超純水機(jī)。其次,在選擇國(guó)產(chǎn)品牌超純水機(jī)時(shí)還需注意以下幾個(gè)方面。第一須具備高效EDI制水模塊。我們知道進(jìn)口品牌密理博、賽默飛、賽多利斯等都主推EDI機(jī)型。EDI(Electrodeionization)又稱連續(xù)電除鹽技術(shù),通過(guò)陰、陽(yáng)離子膜對(duì)
夏季使用實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)的五個(gè)注意事項(xiàng)2023/07/21
實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)一般采用*的反滲透技術(shù)制造純水。純水機(jī)的工作原理是對(duì)水施加一定的壓力,使水分子和離子態(tài)的礦物質(zhì)元素通過(guò)反滲透膜,而溶解在水中的絕大部分無(wú)機(jī)鹽(包括重金屬),有機(jī)物以及細(xì)菌、病毒等無(wú)法透過(guò)反滲透膜,從而使?jié)B透過(guò)的純凈水和無(wú)法滲透過(guò)的濃縮水嚴(yán)格的分開。反滲透膜上的孔徑只有0.0001微米,而病毒的直徑一般有0.02-0.4微米,普通細(xì)菌的直徑有0.4-1微米。純水機(jī)流出的水達(dá)到飲用水標(biāo)準(zhǔn)。下面我們來(lái)看看夏季使用實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)的五個(gè)注意事項(xiàng):1、所有的實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)配件都要避免陽(yáng)光直射近年來(lái),
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