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2018
03-28

ELISA trouble shooting
問(wèn)題一:陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果可能的原因解決的方法試劑/樣品污染試劑和樣品可能被污染，或者由于孔之間的濺灑交叉污染。使用新鮮試劑，小心操作移液器夾心ELISA-檢測(cè)抗體與包被抗體反應(yīng)確定使用的是正確的包被抗體和檢測(cè)抗體，他們之間不會(huì)相互反應(yīng)酶標(biāo)板洗板不*用洗液充滿(mǎn)板空確保每孔被充分洗滌，洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈抗體量過(guò)多導(dǎo)致非特異性結(jié)合根據(jù)推薦用量使用抗體盡量使用較少的抗體問(wèn)題二：酶標(biāo)板整體背景高可能的原因解決的方法結(jié)合反應(yīng)太強(qiáng)或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)檢查底物的稀釋?zhuān)褂媒ㄗh的稀釋度。當(dāng)酶標(biāo)儀顯色足夠
2018
03-26

IHC Trouble Shooting
問(wèn)題一：缺乏染色可能的原因檢測(cè)方法和相應(yīng)的措施沒(méi)有抗原用原位雜交的方法檢測(cè)蛋白表達(dá)（有時(shí)即使能檢測(cè)到mRNA。翻譯也有可能受阻）由于錯(cuò)誤的儲(chǔ)存方法按照說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存。通常，將抗體按照足夠配制單次實(shí)驗(yàn)工作溶液的體積分裝。儲(chǔ)存在手動(dòng)除霜冰箱中（-20到-70℃），避免反復(fù)凍融無(wú)效的一抗或二抗單獨(dú)檢查報(bào)告系統(tǒng)以評(píng)估試劑的有效性。固定不充分嘗試增加固定時(shí)間或改用不同的固定劑過(guò)度固定減少浸潤(rùn)或固定后步驟的時(shí)間。如果必須使用浸潤(rùn)法固定（例如病理實(shí)驗(yàn)室中的尸檢組織或切片），可以用抗原修復(fù)試劑修復(fù)被遮蔽的表位不兼容
2018
03-26

羊血清在免疫組化中的作用
都說(shuō)是封閉，羊血清究竟封閉的是什么（抗原？）那接下來(lái)加一抗怎么又能反應(yīng)結(jié)合？不是封閉了嗎？封閉的目的是為了減少非特異染色。這里，允許小編介紹下免疫組化中封閉血清的原理，封閉血清的原理主要有兩點(diǎn)：*是待檢樣本會(huì)非特異性的和蛋白結(jié)合，從而導(dǎo)致背景過(guò)高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結(jié)合，從這點(diǎn)看，BSA和血清沒(méi)有明顯區(qū)別。第二是待檢樣本中可能會(huì)有Fc受體，可以和抗體恒定區(qū)結(jié)合，與抗體特異性無(wú)關(guān)，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結(jié)合。BSA則無(wú)法封閉Fc
2018
03-22

IP trouble shooting
問(wèn)題一：高背景可能的原因解決方法去污劑不溶性蛋白有殘留離心后立即去除上清，沉淀中留有不溶性蛋白質(zhì)，如果再次有懸浮發(fā)生，再次離心洗滌不充分蓋上管蓋離心前反復(fù)顛倒幾次非特異性蛋白質(zhì)與珠子結(jié)合珠子用BSA預(yù)封閉不充分，確保牛血清白蛋白（組分V）新鮮，新鮮珠子與含1%牛血清白蛋白的PBS孵育1小時(shí)，使用前PBS洗3-4次使用的抗體特異性不強(qiáng)使用親和純化的抗體，預(yù)先吸收使用太多抗體導(dǎo)致非特異性結(jié)合檢查推薦抗體用量。嘗試使用更少的抗體細(xì)胞裂解液中含有太多的細(xì)胞或太多蛋白，導(dǎo)致洗脫液中很多額外的（假陽(yáng)性）蛋白
2018
03-20

WB Trouble Shooting
問(wèn)題一：轉(zhuǎn)膜不充分可能的原因驗(yàn)證或解決方法膜沒(méi)有*均勻濕透使用100%甲醇浸透膜靶蛋白分子量小于10kDa選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間靶蛋白等電點(diǎn)等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液PH值可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH10.5）或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液甲醇濃度過(guò)高過(guò)高甲醇濃度濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時(shí)會(huì)使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠?qū)τ诤竦哪z以及高分子量蛋白需要延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間問(wèn)題二：背景高可能的原因驗(yàn)證或
2018
03-15

預(yù)制膠常見(jiàn)問(wèn)題指南
注意事項(xiàng)★一定要使用我們盒內(nèi)配套的電泳緩沖液；★上樣量和濃度不能過(guò)高。1.我們的預(yù)制膠與哪些品牌電泳槽兼容？●Bio-RadMini-PROTEAN(II/3/TetraSystem)；●HoeferMightySmall(SE250/SE260/SE280)；●LifeTechnology(Invitrogen)；●NovexMini-Cell；●MiniGelTank(A25977)(請(qǐng)與EZbiolab特制擋板配合使用)；●北京六一DYCZ-25E；●君意東方JY-SCZ2+；●天能VE1
2018
03-13

【推薦】蛋白marker精彩問(wèn)答
WesternBlot（WB）即蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，是將蛋白樣本通過(guò)聚丙烯酰胺電泳按分子量大小講蛋白分離，再通過(guò)電場(chǎng)力將蛋白轉(zhuǎn)移到雜交膜上。然后通過(guò)一抗/二抗復(fù)合物對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)的方法。WB是進(jìn)行蛋白質(zhì)分析zui流行和成熟的技術(shù)之一。在WB過(guò)程中，分子量Marker就像個(gè)螺絲釘一樣，只是個(gè)小細(xì)節(jié)，然而就是這樣一個(gè)小細(xì)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著不可忽視的作用。這個(gè)WB參照家族的一員的作用主要是用來(lái)指示蛋白條帶所對(duì)應(yīng)的分子量大小，只有標(biāo)準(zhǔn)量無(wú)誤了，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有說(shuō)服力，除此之外，蛋白標(biāo)準(zhǔn)還有表示轉(zhuǎn)移成功或
2018
03-09

IHC、ELISA和WB區(qū)別
免疫學(xué)三大工具，IHC、Westernblot、ELISA，分別用于定位，定性和定量!IHC（免疫組化）是融合了免疫學(xué)原理（抗原抗體特異性結(jié)合）和組織學(xué)技術(shù)（組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等），通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色，來(lái)對(duì)組織（細(xì)胞）內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。樣本是細(xì)胞或組織，要在顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果，可能出現(xiàn)膜陽(yáng)性、質(zhì)陽(yáng)性和核陽(yáng)性。ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）用到了免疫學(xué)原理和化學(xué)反應(yīng)顯色，待測(cè)的樣品多是血清、血漿、尿液
2018
03-07

血清那些事兒
血清小知識(shí)血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，而且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏男詣e、年齡、生理?xiàng)l件和營(yíng)養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等，其主要作用是提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、提供激素和各種生長(zhǎng)因子、提供結(jié)合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷、對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞的起到某些保護(hù)作用。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛;新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛
2018
02-28

免疫組化步驟剖析（二）
1、血清封閉：組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性；因此需要使用封閉劑進(jìn)行封閉。常用試劑為血清和BSA等。封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，但不能與一抗來(lái)源一致。2、一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間：一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中zui重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果*；孵育時(shí)間與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，4度過(guò)夜（從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min）。具體條件還要摸索。二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間
2018
02-24

免疫（共）沉淀（IP/CoIP）試劑盒常見(jiàn)問(wèn)題匯總
Q：步驟上的可選步驟能否省略？A：該試劑盒是經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的，再進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的時(shí)候?qū)嶒?yàn)室都是要做這個(gè)可選步驟的，建議不要省略，按照說(shuō)明書(shū)操作。Q：proteinA和proteinGbeads怎么選？A：各5ul就可以了Q：超聲破碎冰上操作是必須的嗎？4℃條件能否微調(diào)？A：建議冰上操作，4℃是可以微調(diào)的。Q：beads出現(xiàn)吸不出來(lái)的情況，怎么處理？A：吸之前需注意槍頭要剪一下再吸，如若beads吸不上來(lái)，可加入等體積的20%乙醇混勻后再吸。Q：如果沒(méi)有超聲破碎儀的話(huà)，能不能用酶解的辦法破碎細(xì)胞？A：
2018
02-05

標(biāo)簽抗體知多少
標(biāo)簽抗體，別名為抗原表位，又稱(chēng)抗原決定簇，是抗原分子中決定抗原特異性的特殊區(qū)域或基團(tuán)，是與抗體特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)或序列。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，科研人員可以通過(guò)DNA重組技術(shù)，構(gòu)建包含目的基因以及表位標(biāo)記的融合蛋白，進(jìn)而通過(guò)特異性標(biāo)簽抗體對(duì)其鑒定與純化，以達(dá)到研究的需求。常用的標(biāo)簽包括myc、HA、Flag、His、GST等。1.Flag標(biāo)簽—抗Flag標(biāo)簽抗體Flag標(biāo)簽系統(tǒng)是利用一個(gè)短的親水性八氨基酸肽(DYKDDDDK)融合到目標(biāo)蛋白。Flag標(biāo)簽可位于蛋白質(zhì)的C端或N端，該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于各種
2017
12-22

免疫組化的實(shí)驗(yàn)步驟剖析（一）
1、標(biāo)本固定：固定的目的是：①，防止標(biāo)本從玻片上脫落；②，除去防礙抗原—抗體結(jié)合的類(lèi)脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；③，固定的標(biāo)本易于保存。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛。2、脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對(duì)組織要*浸蠟、切片時(shí)刀片要干凈和鋒利。否則容易裂片和脫片等。3、脫蠟和水化：這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。脫蠟可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分別10min，但當(dāng)天制好的切片可以60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高
2017
12-15

產(chǎn)品問(wèn)答之霍亂毒素B亞單位（CTB）
Q:什么是霍亂毒素？A:霍亂毒素由（Choleratoxin,CT）兩個(gè)亞單位組成，即A亞單位（CTA）和B亞單位（CTB）。A亞單位是霍亂毒素的活性部分，B亞單位的主要功能是通過(guò)與哺乳動(dòng)物小腸上皮細(xì)胞上的單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GM1結(jié)合而使得A亞單位進(jìn)入細(xì)胞。Q:霍亂毒素是如何反激活的？A:霍亂毒素由霍亂操縱子（ctx）編碼，從5'到3'方向，依次是反激活因子ToxR的識(shí)別序列、啟動(dòng)子、A基因（ctxA）、B基因（ctxB）和不依賴(lài)于r因子的轉(zhuǎn)錄終止系列?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為操縱子中只有一個(gè)啟動(dòng)子，ctx
2017
11-30

血清常見(jiàn)問(wèn)題解答
血清小知識(shí)血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，而且血清組成及含量常隨供血?jiǎng)游锏男詣e、年齡、生理?xiàng)l件和營(yíng)養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等，其主要作用是提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、提供激素和各種生長(zhǎng)因子、提供結(jié)合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷、對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞的起到某些保護(hù)作用。胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛;新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛
2017
11-23

蛋白Marker使用指南
在westernBlot過(guò)程中，蛋白Marker雖然是其中小小的一環(huán)，但是這個(gè)小細(xì)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不可忽視。Marker在蛋白電泳中的作用主要是用來(lái)指示蛋白條帶所對(duì)應(yīng)的分子量大小，只有標(biāo)準(zhǔn)量無(wú)誤，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有說(shuō)服力。此外，Marker還能顯示轉(zhuǎn)膜是否成功以及蛋白在凝膠上的電泳程度的作用。因此選擇正確的蛋白Marker也是westernblot實(shí)驗(yàn)成功的必要條件之一?？傮w來(lái)說(shuō)，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)可以分成未染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)二個(gè)級(jí)別。未染色的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)未染色的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)是zu
2017
11-17

WB試驗(yàn)之如何選擇內(nèi)參抗體
檢測(cè)某一個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物或者要比較表達(dá)產(chǎn)物量的相對(duì)變化，方法是westernblot。而WesternBlot試驗(yàn)中比較這些的前提條件是等量的細(xì)胞上樣，這樣才有比較的基礎(chǔ)。而人為的操作會(huì)產(chǎn)生一定的誤差，這些誤差可以通過(guò)測(cè)定每個(gè)樣品中實(shí)際轉(zhuǎn)到膜上的內(nèi)參來(lái)校正。因此選擇一個(gè)合適的內(nèi)參抗體來(lái)校正上樣誤差是非常重要的。所以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤esternBlot實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中需要有良好的參照體系，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析才具有說(shuō)服性。在WesternBloting實(shí)驗(yàn)中，可能內(nèi)參即是內(nèi)部參照(InternalControl)
2017
10-10

預(yù)制膠—讓您的WB省時(shí)省力更省心
Westernblotting是一個(gè)步驟繁多的實(shí)驗(yàn)，每一步都會(huì)對(duì)zui后的結(jié)果產(chǎn)生影響，電泳過(guò)程是其中關(guān)鍵重要的一步。好的電泳能讓目的條帶整齊，結(jié)果圖讓人眼前一亮。要做好電泳也并非易事，凝膠質(zhì)量在其中扮演著重要作用。電泳的支持介質(zhì)為聚丙烯酰胺凝膠，該凝膠的聚合由丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體在自由基的催化下完成。常用的催化聚合方法有兩種，分別為化學(xué)聚合法和光聚合法，實(shí)驗(yàn)室配制凝膠通常為化學(xué)聚合。在聚合過(guò)程中，TEMED催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生
2017
09-21

MAPK級(jí)聯(lián)激活
絲裂原活化蛋白激酶MAPK（mitogen-activatedproteinkinase）是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)酶的活性，參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié)，并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。MAPK是一組能被不同的細(xì)胞外刺激，如細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。該通路的基本組成是一種從酵母到人類(lèi)都保守的三級(jí)激酶模式，包括MAPK激酶激酶（MAPkinasekinasekinase，MKKK）、MAPK
2017
09-05

抗體相關(guān)問(wèn)題FAQ
1.如何保存和分裝抗體？對(duì)于許多抗體而言，分裝為小等份在-20℃或-80℃下凍存是*的保存條件?？贵w保存應(yīng)避免反復(fù)凍融，分裝可以zui大限度減少凍融對(duì)抗體造成的損壞，還可避免多次從同一管中移取抗體而引入污染。但是每份不應(yīng)該少于10uL。分裝的體積越小，抗體的濃度受蒸發(fā)和管壁吸附的影響就會(huì)越大。大部分情況下，抗體在4℃條件下能夠保存1-2周。但有部分特例。為了防止微生物污染，可在抗體中加入適當(dāng)濃度的NaN3。如果要用抗體對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色或處理，或者要用抗體進(jìn)行體內(nèi)研究，則不能使用含NaN3的抗體制

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