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產(chǎn)品分類：酶類染色

儲(chǔ)存條件：4℃,避光,3個(gè)月

用途：腺苷三磷酸酶染色

注意事項(xiàng)：主要由孵育液、硝酸鈷、硫化銨、陰性對(duì)照孵育液等組成。酶活性部位呈棕黑色或黑色。

配制與標(biāo)定的實(shí)驗(yàn)原理：

1、用EDTA二鈉鹽配制EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的原因；

EDTA是四元酸，是一種白色晶體粉末，常用H4Y表示，溶解度很小，室溫溶解度為0.02g/100g H2O。

2、標(biāo)定EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作基準(zhǔn)試劑，基準(zhǔn)試劑的預(yù)處理：稱量前一般應(yīng)先用稀鹽酸洗去氧化層，然后用水洗凈，烘干。

配制步驟：

1、取適量鋅片放在100mL燒杯中，用0.1mol·L-1 HCl溶液（自配）清洗1min，再用自來水、純水洗凈，烘干、冷卻。

2、用直接稱量法在干燥小燒杯中準(zhǔn)確稱取0.15～0.2g Zn，蓋好小表面皿。

3、用滴管從燒杯口加入5mL 1:1 鹽酸，待Zn溶解后吹洗表面皿、杯壁，小心地將溶液轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，用純水稀釋至標(biāo)線，搖勻。

實(shí)驗(yàn)方法與判定：

1.對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性

2.對(duì)照品溶液的配制：精密量取腦對(duì)照品適量，加無水乙醇制成每1ml含腦1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

3.色譜條件：以交聯(lián)鍵合聚乙二醇為固定相的毛細(xì)管柱；柱溫120℃；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測(cè)器溫度250℃；分流進(jìn)樣，分流比10:1。理論塔板數(shù)按腦計(jì)算應(yīng)不低于10000。

4.實(shí)驗(yàn)方法：配制的對(duì)照品溶液，一份置冷處保存，一份置室溫中保存，在第1、3、7、10、15天重新配制一份對(duì)照品溶液，三種儲(chǔ)備液同時(shí)稀釋制成每1ml中約含50ug的溶液。照氣相色譜法，并依據(jù)新對(duì)照品的峰面積計(jì)算原對(duì)照品溶液的含量。記錄下來，保證原對(duì)照品溶液含量在考察期相對(duì)平均偏差不超過2.0%，驗(yàn)證對(duì)照品溶液在使用期內(nèi)穩(wěn)定可靠。

川芎（標(biāo)準(zhǔn)品） 3-Phosphoglyceric Phosphokinase白介-10受體β抗體包裝250mg

川芎(標(biāo)準(zhǔn)品) d-ribulose 1,5-diphosphate/RuDP白介-12受體β1抗體包裝1g

川續(xù)斷皂苷VI（標(biāo)準(zhǔn)品） Acidic Protease from Aspergillus 白介-12受體β2抗體包裝25g

川續(xù)斷皂苷乙（標(biāo)準(zhǔn)品） Prometryn白介15受體α抗體包裝5g

穿山（標(biāo)準(zhǔn)品） Sulforaphane白介17受體抗體包裝25g

穿山龍（標(biāo)準(zhǔn)品） Mecobalamin白介-17B受體抗體包裝5g

（標(biāo)準(zhǔn)品） (S)-Ketoprofen trometamol白介-18受體β鏈抗體包裝1g

內(nèi)酯（標(biāo)準(zhǔn)品） (S)-Ketoprofen trometamol白介21抗體包裝25g

船形烏頭（標(biāo)準(zhǔn)品） Phytagel白介21受體抗體包裝5g

垂盆草（標(biāo)準(zhǔn)品） (S)-(+)-Ketoprofen白介-22抗體包裝1g

椿皮（標(biāo)準(zhǔn)品） sulfosalicyclic acid白介29抗體包裝25g

慈溪麥冬皂苷A 1-Amino-2-naphthol-4-sulfonic Acid 白介22受體結(jié)合蛋白抗體包裝5g

次野鳶尾黃（標(biāo)準(zhǔn)品） 10,11-Dihydro-10-hydroxy Carbamazepine 白介-1受體相關(guān)激4抗體包裝1g

甘草查爾(標(biāo)準(zhǔn)品) S-Notoginsenoside R2干擾調(diào)節(jié)因子4抗體包裝5g

槐苷 Zinc acetate胰島樣生長(zhǎng)因子1受體β/IGF-IRβ 抗體包裝1g

粉紅單端孢Trichothecium│roseum 質(zhì)量規(guī)格：≥40%可溶性O(shè)X40L試劑盒花椒;8-Methoxypsoral

鏈霉菌Streptomyces│sp. 質(zhì)量規(guī)格：≥50%,BR可溶性Endoglin試劑盒環(huán)氧澤瀉烯;Alismoxide

Streptococcus castoreus模式菌株: 未知 質(zhì)量規(guī)格：≥90%可溶性CD86試劑盒海柯皂苷元;Hecogenin
ATPase染色液Gentamicin/FITC  熒光su標(biāo)記慶大霉su規(guī)格： 1ml

Tetracycline/OVA  四環(huán)su偶聯(lián)雞卵白蛋白規(guī)格： 2mg

Oxytetracycline/BSA  土霉su偶聯(lián)牛血清白蛋白規(guī)格： 2mg

Oxytetracycline/OVA  土霉su偶聯(lián)雞卵白蛋白規(guī)格： 2mg

streptomycin/OVA  鏈霉su偶聯(lián)血藍(lán)蛋白規(guī)格： 5mg

使用方法：

1.  常用篩選濃度

注意：用來篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株的工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞類型，培養(yǎng)基，生長(zhǎng)條件和細(xì)胞代謝率而變化，推薦使用濃度為50-1000μg/mL。對(duì)于第一次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過建立殺滅曲線（kill curve），即劑量反應(yīng)性曲線，來確定最佳篩選濃度。

一般而言，哺乳動(dòng)物細(xì)胞50-500μg/mL；細(xì)菌/植物細(xì)胞20-200μg/mL；真菌300-1000μg/mL。

2. 殺滅曲線的建立

注意：為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素濃度，可通過建立殺滅曲線（劑量反應(yīng)曲線）來實(shí)現(xiàn)，至少選擇5個(gè)濃度。

1）  第一天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2培養(yǎng)過夜；注：對(duì)于需要更高密度來檢測(cè)活力的細(xì)胞，可增加接種量。

2）  根據(jù)細(xì)胞類型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定50，100，250，500，750，1000μg/mL。先用去離子水或者PBS buffer按照1:10的比例將母液稀釋到5 mg/ml，然后按照下表稀釋到相應(yīng)濃度的工作液。

3）  第二天：替換舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。

4）  接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。

5）  按照固定的周期（如每2天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。

3.   穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選

1）  轉(zhuǎn)染48h后，用含有適當(dāng)濃度的潮霉素B篩選培養(yǎng)基來傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。

注意：細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷。則當(dāng)細(xì)胞過于稠密，其效率會(huì)降低。為了得到較好的篩選效果，最好將細(xì)胞稀釋至豐度不超過25%

2）  每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。

3）  篩選7天后觀察并評(píng)估細(xì)胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這取決于宿主細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染，以及篩選效果。

4）   挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆于35mm細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

5）   之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。