本試劑盒提供了CCCP 作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽性對照。

　　    對于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測100 個樣品;對于12 孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測200 個樣品。

　　使用說明：

　　1. JC-1 染色工作液的配制

　　    六孔板每孔所需JC-1 染色工作液的量為1mL，其他培養(yǎng)器皿的JC-1 染色工作液的用量以此類推;對于細(xì)胞懸液每50～100 萬細(xì)胞需0.5mL JC-1 染色工作液。取適量JC-1（200×），按照每50μL JC-1（200×）加入8mL 超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2mL JC-1 染色緩沖液 （5×），混勻后即為JC-1 染色工作液。

　　2. 陽性對照的設(shè)置

　　    把試劑盒中提供的CCCP（10mM）*按照1∶1000 的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至10μM，處理細(xì)胞20 分鐘。隨后按照下述方法裝載JC-1，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細(xì)胞，通常10μM CCCP處理20 分鐘后線粒體的膜電位會*喪失，JC-1 染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光;而正常的細(xì)胞經(jīng)JC-1 染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對于特定的細(xì)胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料決定。

　　3. 對于懸浮細(xì)胞

　　（1） 取10～60 萬細(xì)胞，重懸于0.5mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

　　（2） 加入0.5mL JC-1 染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 分鐘。

　　（3） 在孵育期間，按照每1mL JC-1 染色緩沖液（5×）加入4mL 蒸餾水的比例，配制適量的JC-1 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

　　（4） 37℃孵育結(jié)束后，600g 4℃離心3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。

　　（5） 用JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌2 次：加入1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g 4℃離心3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600g 4℃離心3～4 分鐘，沉淀細(xì)胞，棄上清。

　　（6） 再用適量JC-1 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細(xì)胞儀分析。

　　4. 對于貼壁細(xì)胞

　　注意：對于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細(xì)胞儀檢測，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。

　　（1） 對于六孔板的一個孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實驗如有必要可以用PBS 或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入1mL 細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

　　（2） 加入1mL JC-1 染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 分鐘。

　　（3） 在孵育期間，按照每1mL JC-1 染色緩沖液（5×）加入4mL 蒸餾水的比例，配制適量的JC-1 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

　　（4） 37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌2 次。

　　（5） 加入2mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

　　（6） 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

　　5. 對于純化的線粒體

　　（1） 把配制好的JC-1 染色工作液再用JC-1 染色緩沖液（1×）稀釋5 倍。

　　（2） 0.9mL 5 倍稀釋的JC-1 染色工作液中加入0.1mL 總蛋白量為10～100μg 純化的線粒體。

　　（3） 用熒光分光光度計或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進(jìn)行時間掃描（time scan），

　　激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為485nm 時，

　　可以在475～520nm 范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟6 中的波長設(shè)置進(jìn)行熒光檢

　　測。

　　（4） 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。

　　6. 熒光觀測和結(jié)果分析

　　    檢測JC-1 單體時可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm，發(fā)射光設(shè)置為530nm;檢測JC-1 聚合物時，可以把激發(fā)光設(shè)置為525nm，發(fā)射光設(shè)置為590nm。

　　注意：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在大激發(fā)波長和大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測JC-1 單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設(shè)置，如觀察GFP 或FITC 時的設(shè)置;檢測JC-1聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3 時的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。

　　保存條件：

　　-20℃避光保存，盡量避免反復(fù)凍融，有效期一年。

　　超純水和JC-1 染色緩沖液（5×）也可4℃保存。

　　注意事項：

　　1. JC-1（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

　　2. 必須先把JC-1（200×）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后，才可以加入JC-1染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-1染色緩沖液（1×）再加入JC-1（200×），這樣JC-1會很難充分溶解，會嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測。

　　3. 裝載完JC-1后用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌時，使JC-1染色緩沖液（1×）保持4℃左右，此時的洗滌效果較好。

　　4. JC-1探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。

　　5. 請勿把JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1染色緩沖液（5×）。

　　6. 如果發(fā)現(xiàn)JC-1染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在37℃加熱。

　　7. CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護(hù)。

　　8. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。