大鼠結(jié)合珠蛋白/觸珠蛋白(Hpt/HP)北京

Hu人周期素依賴性激酶4(CDK-4)

1.4　免疫測定在臨床檢驗中的應(yīng)用　　由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測定的應(yīng)用范圍極廣，在臨床檢驗中可用于測定： 1) 體液中的各種蛋白質(zhì)，包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等。 2) 激素，包括小分子量的甾體激素等。 3) 抗生素和藥物。 4) 病原體抗原，HBsAg、HBeAg等。 5) 另外，也可利用純化的抗原檢測標(biāo)本中的抗體，例如抗-HBs等。;1.5． 標(biāo)記的免疫測定　　如上所述，免疫測定是一種很敏感的測定方法，抗原抗體反應(yīng)后直接測定形成的沉淀或濁度，敏感度可達(dá)5~10μg/ml，但在臨床檢驗中，某些待測物在標(biāo)本中的含量遠(yuǎn)低于這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法。標(biāo)記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質(zhì)加以標(biāo)記，通過測定標(biāo)記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標(biāo)記物分別為放射性核素和酶，zui后用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比直接測定沉淀物提高數(shù)百至數(shù)千倍。在標(biāo)記免疫測定中，一般加入過量的標(biāo)記試劑以保證與待測物*反應(yīng)。以標(biāo)記抗體（Ab※）檢測抗原（Ag）為例，反應(yīng)式如下：Ag+ Ab※ → AgAb※+ Ab※。在反應(yīng)產(chǎn)物中有與Ag結(jié)合的Ab※和游離和Ab※，如不將兩者分離而測定標(biāo)記物，測得的結(jié)果將為兩者之和。因此，游離標(biāo)記物與結(jié)合標(biāo)記物的分離是標(biāo)記免疫測定中的重要步驟?？刹捎枚喾N手段，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然后再與標(biāo)記的抗原或抗體直接反應(yīng)，結(jié)合的標(biāo)記物被固定在載體上，而游離的標(biāo)記物留于溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的Ab※除去，結(jié)合標(biāo)記物的測定可在固相上進(jìn)行。;1.6．酶免疫測定　　酶免疫測定（enzyme immunoassay）可分為均相（homogenous）和非均相（heterogenous）兩種類型。在均相EIA中可不需進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離而直接測定標(biāo)記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。均相EIA在臨床檢驗中較少應(yīng)用。非均相EIA需*行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測定方法在1971年zui初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay），簡稱ELISA，在國內(nèi)有譯作酶聯(lián)免疫吸附試驗或酶標(biāo)，已習(xí)用。;ELISA中的試劑（1）－免疫吸附劑在臨床檢驗中一般采用商品試劑盒進(jìn)行測定。前文（2.2）已述，ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）。（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）。（3）酶的底物。（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）。（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液。（6）洗滌液。（7）酶反應(yīng)終止液。3.1　免疫吸附劑已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個月。有些不完整的試盒，僅供應(yīng)包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被。以下簡述固相載體和包被過程。;3.1.1　固相載體固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。可作ELISA中載體的材料很多，zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。;ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板zui為常用，于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結(jié)果。現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。;良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后，分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計算全部讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應(yīng)小于10%。;與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點為質(zhì)軟板薄，可剪割，價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。;為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗：用其他免疫學(xué)測定方法選出一個典型的陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本，將它們進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測定，然后比較結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果差別zui大，這種載體就是這一ELISA測定項目的zui合適的固相載體。;在ELISA中，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸附面積約為200mm2，小珠均為1000mm2，將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結(jié)合位點的暴露面處于*反應(yīng)狀態(tài)，因此珠式ELISA的反應(yīng)往往更為靈敏。小珠的另一特點是更易于使洗滌*，使用特殊的洗滌器，使小珠在洗滌過程中滾動淋洗，其洗滌效果遠(yuǎn)較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。;小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標(biāo)本的反應(yīng)量也相應(yīng)增加。板式及珠式ELISA的標(biāo)本量一般為100-200ul，而小試管可根據(jù)需要加大反應(yīng)體積，標(biāo)本反應(yīng)量的增加有助于試驗敏感性的提高。小試管還可以當(dāng)作比色杯，zui后直接放入分光光度計中比色。;也有應(yīng)用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優(yōu)點是表面積*，反應(yīng)在懸液中進(jìn)行，其速率與液相反應(yīng)近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體，反應(yīng)后用磁鐵的吸引進(jìn)行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀器。;3.1.2 　包被的方式將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用于。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當(dāng)抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區(qū)域時，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對該抗原的特異抗體作預(yù)包被，其后通過抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化。此間接結(jié)合在固相上的抗原遠(yuǎn)離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法（見2.2.4），試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。間接包被的另一優(yōu)點是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體時，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合。可將聚苯乙烯板先經(jīng)紫外線照射（例如30W紫外燈，75cm照射12小時），以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預(yù)包被，也可提高核酸的結(jié)合力。也可用親和素生物素系統(tǒng)作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。;脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。抗心磷脂抗體的ELISA試劑一般采用這種包被方式。

3.2 包被用緩沖液及zui適包被抗原濃度的優(yōu)化3.2.1 包被緩沖液的優(yōu)化包被抗原時，為了得到*的包被效果，我們采用了碳酸鹽緩沖液（50mM ph9.6 ）、磷酸鹽緩沖液（50mM ph7.6）、以及TRIS鹽酸緩沖液（50 mM ph7.6）三種緩沖液作為包被液，抗原包被濃度為5ug/ml，及2.5ug/ml,酶標(biāo)抗體工作濃度為1：400及1：300，用自動酶標(biāo)儀分析，選擇*的包被緩沖液系統(tǒng)（表5）。同時為了保證緩沖液能夠*保存，我們在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作為防腐劑。

豚鼠端粒酶(TE)

Hu人硫酸皮膚素(DS)

Hu人內(nèi)脂素/內(nèi)臟脂肪素(visfatin)

Pig豬E選擇素(E-Selectin/CD62E)

Human basic fibroblast growth factor,bFGF ELISA Kit

大鼠溴脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)

Human nonmethylated oligonucleotide,NON ELISA Kit

山羊雌激素（E）

Hu人胰島素受體底物2(IRS-2)

Mo小鼠Ⅳ型膠原(ColⅣ)

Mouse Oncostatin-M,OSM ELISA KIT

Pig豬心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTn-Ⅰ)

大鼠骨鈣素/骨谷氨酸蛋白(OC/OT/BGP)

Rat ovalbumin specific IgE,OVA-SlgE ELISA KIT

第③、④種情況，單獨依靠記錄往往是不易察覺的，但在質(zhì)控圖上可以清晰地發(fā)現(xiàn)這種失控。5.3.5統(tǒng)計學(xué)計算方法--"即刻性"質(zhì)控　　以上介紹的質(zhì)控方法基本上與臨床化學(xué)測定的質(zhì)控方法相同，但ELISA有其特殊性，zui合適的質(zhì)控方法尚待研究建立。有些實驗室不是每天進(jìn)行ELISA項目的檢驗，而ELSIA試劑盒效期短，用一批號試劑盒連續(xù)常規(guī)測20次，難度較大。采用"即刻法"質(zhì)控統(tǒng)計方法，只需連續(xù)測3次，即可對第3次檢驗結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。