SILAC服務(wù)簡介-輝駿生物

不同的同位素培養(yǎng)基分別培養(yǎng)實驗組和對照組細胞，達到體內(nèi)標記的目的。在此基礎(chǔ)上進行Co-IP實驗，依靠抗原與抗體之間的專一性反應(yīng)分離得到免疫復(fù)合物；之后，利用LC-MS/MS來定性和定量免疫復(fù)合物中的蛋白：當實驗組與對照組中某個蛋白質(zhì)的含量達到統(tǒng)計學(xué)差異時，判定這個蛋白質(zhì)與誘餌蛋白質(zhì)具有相互作用。

SILAC技術(shù)優(yōu)勢-輝駿生物

1、特異性強，結(jié)果可信，假陽性極低；

2、靈敏度高，樣本需求量少；

3、高通量，能一次性檢測到多種互作蛋白；

4、能直接檢測出與bait蛋白互作的其它蛋白的相對含量

SILAC服務(wù)內(nèi)容-輝駿生物

1、細胞同位素標記

2、蛋白提取、免疫沉淀；

3、蛋白分離

4、液質(zhì)聯(lián)用檢測

5、數(shù)據(jù)庫檢索和定性、定量分析

6、相互作用蛋白的生物信息學(xué)分析

SILAC技術(shù)應(yīng)用-輝駿生物

3.5.1野生型細胞系

1、分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)2組相同的野生型細胞，培養(yǎng)至第5~6代時做標記測試；

2、待標記*后，取等量的2組細胞提取蛋白質(zhì)；

3、提取的輕鏈、重鏈細胞總蛋白分別用Normal IgG和抗誘餌蛋白的特異性抗體做免疫共沉淀（Co-IP）；

4、混合輕、重鏈Co-IP產(chǎn)物，SDS-PAGE分離；

5、膠內(nèi)酶切，肽段抽提、純化；

6、LC-MS/MS定性和定量免疫復(fù)合物中的蛋白質(zhì)（圖1：成對出現(xiàn)的峰為非特異性結(jié)合蛋白）。

3.5.2基因過表達細胞系

1、構(gòu)建興趣基因(帶標簽)的過表達細胞系和對照細胞系；

2、分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)上述2組細胞系，培養(yǎng)至第5~6代時做標記測試；

3、待標記*后，取等量的2組細胞混合并提取蛋白質(zhì)；

4、輕、重鏈蛋白混合物用標簽蛋白的抗體做Co-IP；

5、（1）若抗體和磁珠非化學(xué)偶聯(lián)，Co-IP洗脫液中常有抗體干擾，需要用SDS-PAGE膠分離的方法先去除抗體輕、重鏈，之后做蛋白條帶的膠內(nèi)酶切并抽提肽段；

（2）若抗體和磁珠已化學(xué)偶聯(lián)，做SDS-PAGE確認是否無抗體干擾；在確保無干擾的情況下，進行溶液內(nèi)酶切，之后做LC將肽段混合物分為多個組分；

6、膠內(nèi)酶切的肽段組分或一維LC分離的肽段組分再經(jīng)LC-MS/MS，得到免疫復(fù)合物中蛋白質(zhì)的定性和定量信息。

3.5.3基因干擾細胞系

1、構(gòu)建興趣基因的干擾細胞系和對照細胞系；

2、分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)上述2組細胞系，培養(yǎng)至第5~6代時做標記測試；

3、待標記*后，取等量的2組細胞混合并提取蛋白質(zhì)；

4、輕、重鏈蛋白混合物用興趣蛋白的抗體做Co-IP；

5、同上，亦可采用2種方法：

（1） SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)、膠內(nèi)酶切；

（2） 溶液內(nèi)酶切、LC分離肽段；

6、肽段再經(jīng)LC-MS/MS，得到免疫復(fù)合物中蛋白質(zhì)的定性和定量信息。

客戶須知