雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)意義

1.可廣泛引用與miRNA的靶基因檢測(cè)，可以判斷miRNA是否與靶基因結(jié)合，也可以定量反映miRNA對(duì)目的基因的抑制作用。

2.轉(zhuǎn)錄因子(反式作用因子)存在DNA結(jié)合域，可以與靶標(biāo)啟動(dòng)子中的特異序列(順式作用元件)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達(dá)，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)是檢測(cè)這類轉(zhuǎn)錄因子與基因特異序列的重要手段，是真核基因表達(dá)調(diào)控研究的常用方法。

實(shí)驗(yàn)原理及流程

雙熒光素酶是指螢火熒光素酶和海腎熒光素酶，螢火蟲(chóng)熒光素酶呈黃綠色，波長(zhǎng)550-570nm, 海腎熒光素酶呈藍(lán)色，波長(zhǎng)為480nm。報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是將靶標(biāo)啟動(dòng)子的特定片段插入熒光素酶表達(dá)序列的前方，構(gòu)建帶有靶標(biāo)啟動(dòng)子片段的雙報(bào)道基因質(zhì)粒，然后將待測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞或者其他相關(guān)細(xì)胞系，如果轉(zhuǎn)錄因子能夠激活

啟動(dòng)子，則報(bào)告基因表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子作用強(qiáng)度成正比。加入熒光素酶底物即可根據(jù)熒光強(qiáng)度檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與靶啟動(dòng)子之間是否存在相互作用。熒光素酶報(bào)告基因可構(gòu)建在同一質(zhì)?；蛘邩?gòu)建為兩個(gè)質(zhì)粒，即轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒與靶啟動(dòng)子片段質(zhì)粒。

實(shí)驗(yàn)完成周期及交付標(biāo)準(zhǔn)

實(shí)驗(yàn)周期: 4-6周

交付標(biāo)準(zhǔn):雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、鑒定結(jié)果報(bào)告、分析報(bào)告、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(試劑、 耗材.實(shí)驗(yàn)步驟)、原始數(shù)據(jù)等

需確認(rèn)的信息

1.基因與啟動(dòng)子信息

2.具體分許信息.

3.是否提供質(zhì)粒?

參考文獻(xiàn)

[1] Miraglia E , Nylen, Frank, Johansson K，et al. Entinostat up-regulates the CAMP gene encoding LL-37 via activationof STAT3 and HIF-1a transcription factors[J]. Scientific Reports, 2016, 6:33274.

[2] Azimzadeh P，Olson J A，Balenga N . Reporter gene assays for investigating GPCR signaling.[J]. Methods Cell Biol,2017:89-99.

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