小鼠游離膽固醇（FC）ELISA 技術(shù)試劑盒

　　試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被小鼠游離膽固醇（FC）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的技術(shù)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠游離膽固醇（FC）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

　　1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

　　2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

　　3.細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

　　4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

　　5.保存：如果樣本收集后不及時(shí)技術(shù)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

　　自備物品

　　1.酶標(biāo)儀（450nm）

　　2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

　　3.37℃恒溫箱

　　小鼠游離膽固醇（FC）ELISA技術(shù)試劑盒

　　操作注意事項(xiàng)

　　1.試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡60分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘。

　　2.實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

　　3.預(yù)處理后的樣本無(wú)需稀釋?zhuān)苯尤?0μL加樣即可。

　　4.嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

　　5.所有液體組分使用前充分搖勻。

　　試劑盒組成

　　名稱(chēng)96孔配置48孔配置備注

　　微孔酶標(biāo)板12孔×8條12孔×4條無(wú)

　　標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL0.3mL無(wú)

　　樣本稀釋液6mL3mL無(wú)

　　技術(shù)抗體-HRP10mL5mL無(wú)

　　20×洗滌緩沖液25mL15mL按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋

　　底物A6mL3mL無(wú)

　　底物B6mL3mL無(wú)終止液6mL3mL無(wú)

　　封板膜2張2張無(wú)

　　說(shuō)明書(shū)1份1份無(wú)

　　自封袋1個(gè)1個(gè)無(wú)

　　注：標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：2000、1000、500、250、125、0μmol/L.

　　試劑的準(zhǔn)備

　　20×洗滌緩沖液的稀釋?zhuān)赫麴s水按1：20稀釋?zhuān)?份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

　　洗板方法

　　1.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

　　2.自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

　　小鼠游離膽固醇（FC）ELISA 技術(shù)試劑盒操作步驟

　　1.從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

　　2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

　　3.待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

　　4.隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的技術(shù)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

　　5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

　　6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

　　7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

　　結(jié)果判斷

　　繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)，按曲線(xiàn)方程計(jì)算各樣本濃度值。

　　試劑盒性能

　　1.準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。

　　2.靈敏度：技術(shù)濃度小于10μmol/L。

　　3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類(lèi)似物交叉反應(yīng)。

　　4.重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%、板間變異系數(shù)小于15%。

　　5.貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

　　6.有效期：6個(gè)月

　　免責(zé)聲明

　　1.試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn)，否則所產(chǎn)生的一切后果，由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)，本公司概不負(fù)責(zé)。

　　2.嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，實(shí)驗(yàn)者違反說(shuō)明書(shū)操作，后果由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)。

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