乙酸激酶（acetate kinase，ACK）試劑盒說明書

微量法

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

ACK主要存在于微生物中，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是細(xì)菌碳代謝和能量代謝的關(guān)鍵酶，尤其是在古細(xì)菌甲烷合成代謝中起著中樞作用。

測定原理：

（1）ACK催化乙酸鈉和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸，（3）乳酸脫氫酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD⁺，（4）在340nm下測定NADH氧化生成NAD⁺速率，即可反映ACK活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 18mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：液體×1 支，4℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）工作液的配置，將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中，充分混合溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和180μL工作液，混勻，立即記錄340nm處 20s時的吸光值A(chǔ)1和3min20s后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1-A2。