人抗神經(jīng)/節(jié)苷脂抗體(GM1)試劑盒

工作原理

• 間接法：預(yù)先將人抗神經(jīng)/節(jié)苷脂抗體（GM1）捕獲抗原包被在微孔板上。加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品以及 HRP 標(biāo)記的檢測(cè)抗體后，溫育并洗滌。底物 TMB 在過(guò)氧化物酶催化下，先轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，再在酸作用下變?yōu)樽罱K的黃色。顏色深淺與樣品中的人抗神經(jīng)/節(jié)苷脂抗體（GM1）呈正相關(guān)，通過(guò)酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），即可計(jì)算樣品濃度。

• 雙抗體夾心法：把抗 GM1 抗體包被于酶標(biāo)板，樣本中的 GM1 抗體與之結(jié)合形成固相抗原復(fù)合物。隨后加入生wu素化的抗 GM1 抗體，再加入 ABC 復(fù)合物與生物wu素抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。加入 TMB 顯色底物，顯色情況與樣本中 GM1 抗體含量成正比，同樣借助酶標(biāo)儀測(cè)定 OD 值來(lái)定量或定性分析抗體含量。

試劑盒構(gòu)成

• 微孔酶標(biāo)板：已包被抗體或抗原，為抗原抗體反應(yīng)提供場(chǎng)所，如 96 孔配置為 12 孔 ×8 條，48 孔配置為 12 孔 ×4 條。

• 標(biāo)準(zhǔn)品：通常有 6 管，濃度依次為特定梯度，如 80、40、20、10、5、2.5 ng/mL ，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

• 樣本xi釋液：用于稀釋樣本，確保樣本濃度處于試劑盒可檢測(cè)范圍內(nèi)，不同規(guī)格試劑盒的體積有所差異，如 96 孔配置為 6mL，48 孔配置為 3mL。

• 檢測(cè)抗體 - HRP：與樣本中的抗體或抗原結(jié)合，催化底物顯色，96 孔配置為 10mL，48 孔配置為 5mL。

• 洗滌緩沖液：一般為 20× 濃縮液，使用時(shí)需按 1：20 用蒸餾水稀釋?zhuān)?96 孔配置的 25mL 濃縮液，可稀釋出 500mL 洗滌液，用于洗去未結(jié)合的物質(zhì)，減少非特異性反應(yīng)。

• 底物 A、B：兩者混合后在酶的作用下發(fā)生顯色反應(yīng)，不同規(guī)格試劑盒中兩者的體積一般相同，如 96 孔和 48 孔配置中，底物 A、B 均為 6mL 和 3mL。

• 終止液：用于終止顯色反應(yīng)，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，體積與底物 A、B 對(duì)應(yīng)，如 96 孔配置為 6mL，48 孔配置為 3mL。

• 封板膜、說(shuō)明書(shū)、自封袋：封板膜用于在溫育過(guò)程中防止液體蒸發(fā)和外界污染，一般有 2 張；說(shuō)明書(shū)詳細(xì)介紹試劑盒的使用方法、注意事項(xiàng)、檢測(cè)原理等；自封袋用于保存未使用完的試劑盒組件。

樣本要求

• 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時(shí)或 4℃過(guò)夜，然后以 1000×g 離心 20 分鐘，取上清。若暫時(shí)不檢測(cè)，上清可置于 -20℃或 -80℃保存，但要避免反復(fù)凍融。

• 血漿：使用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，采集后的 30 分鐘內(nèi)，于 2 - 8℃以 1000×g 離心 15 分鐘，取上清檢測(cè)。保存條件與血清相同。

• 組織勻漿：用預(yù)冷的 PBS (0.01M, pH = 7.4) 沖洗組織，去除殘留血液，稱(chēng)重后剪碎。按 1:9（一般比例）的重量體積比，將剪碎的組織與 PBS 加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。還可通過(guò)超聲破碎或反復(fù)凍融進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，最后以 5000×g 離心 5 - 10 分鐘，取上清檢測(cè)。

• 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：以 1000×g 離心 20 分鐘，取上清檢測(cè)。保存方式與血清一致。需注意，標(biāo)本溶血會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，溶血標(biāo)本不宜用于此項(xiàng)檢測(cè)。

操作流程

1. 準(zhǔn)備工作：從冷藏環(huán)境取出試劑盒后，在室溫平衡后方可使用。按 1：20 用蒸餾水稀釋 20× 洗滌緩沖液。準(zhǔn)備好酶標(biāo)儀（450nm 檢測(cè)波長(zhǎng)濾光片，570nm 或 630nm 校正波長(zhǎng)濾光片）、高精度加樣器及對(duì)應(yīng)槍頭、37℃恒溫箱等器材。

2. 加樣：從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50μL；樣本孔中加入待測(cè)樣本 50μL；空白孔不加。

3. 溫育與結(jié)合：除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體 100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。

4. 洗滌：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液（350μL），靜置 1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板 5 次（也可用洗板機(jī)洗板）。

5. 顯色：每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。

6. 終止與讀數(shù)：每孔加入終止液 50μL，15min 內(nèi)，在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的 OD 值。

性能特點(diǎn)

• 檢測(cè)范圍：一般在 2.5 ng/mL - 80 ng/mL，不同品牌試劑盒會(huì)有所差異，例如上海信裕生物科技有限公司的產(chǎn)品檢測(cè)范圍為 1.563 - 100mIU/ml。

• 靈敏度：多數(shù)試劑盒能檢測(cè)到小于 0.1 ng/mL 的濃度，如上海仁捷生物科技有限公司的產(chǎn)品靈敏度可達(dá)此標(biāo)準(zhǔn)，上海信裕生物的產(chǎn)品最小可測(cè)人 Anti - Ganglioside M1 Antibody 達(dá) 0.938mU/ml。

• 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類(lèi)似物交叉反應(yīng)，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

• 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于 10% ，板間變異系數(shù)小于 15% ，保證了不同批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性