Annexin V-FITC/PI Apoptosis Assay Kit

Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

產(chǎn)品簡介：

磷脂酰絲氨酸（PS）是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常細(xì)胞中，PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向細(xì)胞膜外側(cè)，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。而Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被*為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。

本產(chǎn)品將Annexin V進(jìn)行綠色熒光素（FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但對凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此采用Annexin V與PI雙染的方法，就可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。

本試劑盒可應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞凋亡檢測（不推薦用于檢測組織樣本）。

產(chǎn)品組成：

使用方法：

1.細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

A．懸浮細(xì)胞：

（1）收集細(xì)胞至離心管中1000-2000rpm離心5min，小心去除上清。

（2）用1ml 4℃預(yù)冷PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

（3）再加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

B．貼壁細(xì)胞：

（1）吸出細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管中，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量不含EDTA的胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。

（2）室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。

（3）加入以上步驟中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

注：加入的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-FITC導(dǎo)致染色失敗。

（4）用1ml 4℃預(yù)冷PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

（5）再加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

2.用去離子水按1：4稀釋Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml去離子水）；

3.用250μl稀釋過的Binding Buffer重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×10⁶/ml；

4.取100μl的細(xì)胞懸液于5 ml流式管中，加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻；

5.室溫(20-25℃)避光孵育10min；

6.上機(jī)前5min加入10μl碘化丙啶溶液，輕輕混勻；

7.上機(jī)前在反應(yīng)管中補(bǔ)加400μl PBS重懸細(xì)胞， 避光保存，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀（FACS）檢測， Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

保存條件：

4℃避光保存，有效期一年。