堿性磷酸酶染色實驗服務(wù)

堿性磷酸酶染色實驗技術(shù)簡介:

堿性磷酸酶(AKP) 的顯示方法zui早由Gomeri (1939) 提出，現(xiàn)在這種方法稱為Gomeri法。堿性磷酸酶是指磷酸單酯酶I,它能在pH8. 6~10.0的zui適條件下分解磷酸單酯，對于與磷酸相接的醇基沒有特異性，Gomeri法是讓該酶在堿性條件下，分解甘油磷酸鈉，產(chǎn)生磷酸根。

堿性磷酸酶染色實驗技術(shù)原理:

在一定條件下，使細(xì)胞中的酶作用于酶的底物，使其產(chǎn)物在原地進(jìn)行捕捉、沉淀轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物。細(xì)胞組織中的堿性磷酸酶在堿性(PH9.0- 9.6)環(huán)境下使作用液中的底物(a- 磷酸萘酚鈉)水解，產(chǎn)生出a蔡酚，然后再與偶氮鹽偶聯(lián)，生成不溶性的耐曬染料(zui終產(chǎn)物的顏色因所用偶氮鹽的品種不同而有所不同)。

實驗操作流程:

1、取材、固定、包埋、切片;

2.取已粘好烘干的切片兩塊，放入二甲苯(一)→二甲苯(二) (各3-4分鐘) 的染缸中進(jìn)行脫蠟，再經(jīng)100%乙醇(一)- +100%乙醇(二) - -95%乙醇- -90%乙醇- -70%乙醇- -30%乙醇- +z水。 每級各一分鐘，在移切片時，用鑷子夾住切片震蕩并提起，放下反復(fù)幾次，在移入下-染缸邊緣前稍停留。讓溶液滴凈后,再入下一染缸，以免把上一染缸溶液過多帶入下-染缸，而影響切片質(zhì)量;

3.將其中一塊切片以蠟筆作-標(biāo)記(用作對照組切片)，放入沸水中煮沸5分鐘;

4.將兩塊切片均放入AKP作用液中孵育30-60分鐘，作用液要事先預(yù)熱到37"C,水浴中進(jìn)行:

5、取出切片在蒸餾水中洗滌;

6、放入硝酸鈷溶液2-3分鐘;

7.蒸餾水沖洗干凈，否則切片易被污染，影響定位;

8、切片浸入硫化銨中2-3分鐘;

9.蒸餾水沖洗干凈;

10.經(jīng)各級酒精脫水。即30%乙醇- -70%乙醇- -90%乙醇- -950%乙醇- -100%乙醇 (二)- -100%乙醇 (一)，各級一分鐘在顯微鏡下觀察，細(xì)胞中有黑色沉淀存在的地方，就表明有酶的存在。煮沸的對照切片無黑色沉淀。