產(chǎn)品名稱： IP Kit， IP試劑盒（瓊脂糖珠法）

貨號(hào)： IF6801

品牌：Engibody

對(duì)應(yīng)關(guān)鍵詞：IP Kit, IP試劑盒，免疫沉淀Kit

試劑盒優(yōu)勢(shì)

1、Protein A/G瓊脂糖珠確保與大多數(shù)一抗的良好結(jié)合，無(wú)論是來(lái)自小鼠源抗體還是兔源抗體

2、在30分鐘內(nèi)快速免疫沉淀，以減少背景并提高瞬時(shí)蛋白質(zhì)復(fù)合物的捕獲

3、在洗滌劑、低pH緩沖液或普通質(zhì)譜溶劑存在下，蛋白質(zhì)A/G不會(huì)脫落

4、方便，全面的IP試劑盒包含瓊脂糖珠和完成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的所有必要緩沖液以及抗體的同型對(duì)照

5、現(xiàn)貨庫(kù)存，訂購(gòu)秒發(fā)

試劑盒描述

免疫沉淀（IP）試劑盒（蛋白A/G瓊脂糖珠）

適用實(shí)驗(yàn)

•傳統(tǒng)IP和下游WB

•IP用于非還原條件下的下游分析，如酶活性測(cè)定、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究

試劑盒組分

足夠用于：40個(gè)IP反應(yīng)，使用25µL beads懸液/反應(yīng)

•蛋白A/G瓊脂糖珠，1 mL，組分貨號(hào)：IF0001，儲(chǔ)存于4°C

•IP裂解緩沖液，50 mL，組分貨號(hào)：IF6601，儲(chǔ)存于4°C

•IP洗滌緩沖液，50 mL，組分貨號(hào)：IF9210，儲(chǔ)存于4°C

•洗脫緩沖液，4 mL，組分貨號(hào)：IF9213，儲(chǔ)存于4°C

•中和緩沖液，0.5 mL，組分貨號(hào)：IF9216，儲(chǔ)存于4°C

•樣品上樣緩沖液（還原和變性，5X），1 mL，組分貨號(hào)：IF6740，儲(chǔ)存于-20°C

•正常兔IgG（全分子）同型對(duì)照，100μL，組分貨號(hào)：AT1597，-20°C儲(chǔ)存

•正常小鼠IgG（全分子）同型對(duì)照，100μL，組分貨號(hào)：AT1596，-20°C儲(chǔ)存

試劑盒描述

Immunoprecipitation(IP) 試劑盒(Protein A/G Agarose Beads)

適用實(shí)驗(yàn)

• Traditional IP and downstream WB

• IP for downstream analysis in nonreducing conditions, such as enzyme activity assay, protein structure research

試劑盒組分

Sufficient For: 40 IP reactions, using 25 µL of beads slurry/reaction

• Protein A/G Agarose Beads, 1 mL, Cat: IF0001, store at 4°C

• Lysis Buffer for IP, 50 mL, Cat: IF6601, store at 4°C

• Wash Buffer for IP, 50 mL, Cat: IF9210, store at 4°C

• Elution Buffer, 4 mL, Cat: IF9213, store at 4°C

• Neutralization Buffer, 0.5 mL, Cat: IF9216, store at 4°C

• Sample Loading Buffer (Reducing and Denaturing, 5X), 1 mL, Cat: IF6740, store at -20°C

• Normal Rabbit IgG (Whole Molecule) Isotype Control,100 μL, Cat: AT1597, store at -20°C

• Normal Mouse IgG (Whole Molecule) Isotype Control,100 μL, Cat: AT1596, store at -20°C

IP免疫沉淀流程

A、 哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解

方案一：貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物的裂解

1.小心地從細(xì)胞中取出培養(yǎng)基。

2.用1X PBS洗滌細(xì)胞一次。

3.向細(xì)胞中加入冰冷的IP裂解緩沖液（貨號(hào)：IF6601）。在冰上孵育10-20分鐘，定期混合。

注：蛋白酶/磷酸酶抑制劑cocktail應(yīng)添加到裂解緩沖液中。蛋白酶抑制劑在水溶液中迅速失活，應(yīng)在使用前立即添加到溶液中。

表1.用于不同標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)板的IP裂解緩沖液的建議體積。

板尺寸/表面積      IP裂解緩沖液體積

100 mm皿           500-1000μL

60 mm皿             250-500μL

4.將裂解物轉(zhuǎn)移到微離心管中，并在約13000×。

5.將上清液轉(zhuǎn)移到新試管中，用于蛋白質(zhì)濃度測(cè)定和進(jìn)一步分析。

方案二：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物的裂解

1.以1000×g離心細(xì)胞懸浮液5分鐘，使細(xì)胞沉積。丟棄上清液。

2.通過(guò)將細(xì)胞顆粒懸浮在PBS中洗滌細(xì)胞一次。以1000×g離心5分鐘，使細(xì)胞顆粒化。

3.將預(yù)冷的IP裂解緩沖液（貨號(hào)：IF6601）添加到細(xì)胞中。每50 mg細(xì)胞（即10:1 v/w），使用500μL的IP裂解緩沖液。如果使用大量細(xì)胞，首先向細(xì)胞中加入最終體積的10%的IP溶解緩沖液，然后上下移液混合。將剩余體積的IP裂解緩沖液添加到細(xì)胞懸浮液中。

注：蛋白酶/磷酸酶抑制劑cocktail應(yīng)添加到裂解緩沖液中。蛋白酶抑制劑在水溶液中迅速失活，應(yīng)在使用前立即添加到溶液中。

4.在冰上孵育裂解物5分鐘，并定期混合。以約13000×g離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定和進(jìn)一步分析。

B、 使用蛋白A/G瓊脂糖珠預(yù)清除裂解產(chǎn)物（此步驟是可選的，預(yù)清除裂解物將減少蛋白質(zhì)與瓊脂糖珠子的非特異性結(jié)合。如果下游分析中出現(xiàn)高背景，則可以執(zhí)行此步驟。）

1.通過(guò)向每1mL細(xì)胞裂解液中加入20µL蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖懸液，并在4°C下在旋轉(zhuǎn)器上孵育10分鐘，預(yù)先結(jié)合細(xì)胞裂解液中的非特異性蛋白。

2.通過(guò)在4°C下14000xg離心5分鐘，去除蛋白A/G瓊脂糖珠。將上清液（細(xì)胞裂解液）轉(zhuǎn)移到冰上的新鮮離心管中。

注意：在離心后的這一步驟中，應(yīng)丟棄蛋白A/G瓊脂糖珠，應(yīng)保存上清液以備進(jìn)一步IP。

3.測(cè)定細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)濃度（例如，如果進(jìn)行Bradford測(cè)定，則在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度之前必須將細(xì)胞裂解物稀釋至少1:10。

C、 免疫沉淀IP

注意：

•蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖珠（組分貨號(hào)：IF0001）應(yīng)在使用前充分懸浮。

•除非另有說(shuō)明，否則在4°C下執(zhí)行所有IP步驟。

•所需抗體-抗原復(fù)合物的量和孵育時(shí)間取決于所用系統(tǒng)和抗體的親和力、蛋白質(zhì)相互作用，必須針對(duì)每個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。

•可能需要優(yōu)化每個(gè)應(yīng)用步驟的binding時(shí)間

1.將1 mL上述細(xì)胞裂解物或約1000µg總細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移到1.5 mL微離心管中。添加推薦體積的一抗（最佳抗體濃度應(yīng)根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)確定）和正常IgG（2.5µL），然后在旋轉(zhuǎn)器上在4°C下孵育2小時(shí)或過(guò)夜。

注：正常兔IgG（Cat:AT1597）是一種非特異性抗體，可作為兔一抗的同種型對(duì)照。正常小鼠IgG（Cat:AT1596）也是一種非特異性抗體，可作為小鼠一抗的同種型對(duì)照。

2.添加25µL-40µL充分懸浮的蛋白A/G瓊脂糖珠懸液，以捕獲抗原抗體免疫復(fù)合物。在旋轉(zhuǎn)裝置上于4°C下孵育1-2小時(shí)。

3.通過(guò)在4°C下以2500 rpm（約1000xg）離心5分鐘收集免疫沉淀復(fù)合物。仔細(xì)抽吸并丟棄上清液。

4.用0.5 mL IP洗滌緩沖液（貨號(hào)：IF9210）洗滌復(fù)合物2-3次，每次在溫和旋轉(zhuǎn)裝置上洗滌5-10分鐘，并重復(fù)上述離心步驟。

提示：如果出現(xiàn)高背景，請(qǐng)將洗滌次數(shù)增加至5-6次。

D、 抗原蛋白的洗脫和獲得

推薦兩種方法：

選項(xiàng)A：用洗脫緩沖液洗脫（貨號(hào)：IF9213）。這是一種快速有效的洗脫方法。用中和緩沖液（Cat:IF9216）平衡洗脫的蛋白質(zhì)可能有助于保持其活性。

選項(xiàng)B：用樣品loading buffer緩沖液（貨號(hào)：IF6740）煮沸，離心并獲得上清液，用于凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡。

選項(xiàng)A：用洗脫緩沖液洗脫（非變性洗脫）

該步驟應(yīng)在室溫下進(jìn)行。

注意：珠子在緩沖液中的停留時(shí)間不得超過(guò)20分鐘。

1.向每個(gè)樣品和對(duì)照珠復(fù)合物中添加100µL洗脫緩沖液。

2.在室溫下輕輕搖晃樣品和對(duì)照5分鐘。

3.以8000×g離心珠子復(fù)合物60秒。

4.將上清液轉(zhuǎn)移到新鮮試管中。小心不要轉(zhuǎn)移任何珠子。

5.為了平衡洗脫液，立即向每個(gè)樣品中添加10µL中和緩沖液。然后使用pH計(jì)確保pH值為7-8。

6.立即使用時(shí)，將洗脫的蛋白質(zhì)儲(chǔ)存在2-8°C。儲(chǔ)存在-20°C下，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

選項(xiàng)B：用樣品loading buffer工作液煮沸，離心并獲得用于凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡的上清液。（變性洗脫）

該步驟應(yīng)在室溫下進(jìn)行。樣品上樣緩沖液在使用前應(yīng)處于室溫。

1.制備樣品loading buffer工作液，向24µL裂解緩沖液中加入6µL 5×laoding buffer。

2.向每個(gè)樣品和對(duì)照珠子復(fù)合物中添加30µL樣品loading buffer工作液。

3.將樣品和對(duì)照煮沸10分鐘以使免疫復(fù)合物與珠分離。

4.將樣品和對(duì)照品在8000×g離心60秒，以使任何未溶解的瓊脂糖珠子沉淀。將上清液轉(zhuǎn)移到新鮮試管中。樣品和對(duì)照準(zhǔn)備好進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡。