250U / 5 X 250U PV2 DNA 聚合酶
| 參考價 | ￥100.00-￥500.00 |
- 公司名稱 湖南中晟全肽生化有限公司
- 品牌其他品牌
- 型號250U / 5 X 250U
- 所在地株洲市
- 廠商性質(zhì)生產(chǎn)廠家
- 更新時間2024/7/12 17:24:54
- 訪問次數(shù) 212
| 250U | 100.00元 | 1000000 U可售 |
| 5 X 250U | 500.00元 | 1000000 U可售 |
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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 應用領域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè),制藥/生物制藥 |
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Confidential and Privileged
User Manual For PV2 DNA Polymerase
產(chǎn)品名稱 | Cat. No. | 規(guī)格 | 組分 |
PV2 DNA 聚合酶 | 1401-1 | 250 U | 5X PV2 緩沖液與聚合酶 |
1401-5 | 5 X 250 U | 5X PV2 緩沖液與聚合酶 |
將聚合酶與緩沖液儲存于-20?C.
概述
PV2 DNA 聚合酶是一種超保真DNA聚合酶，該酶結(jié)合了雜交技術與融合技術以獲得*的可靠性、高特異性和長的目標長度性能，顯著地減少全部的PCR延伸時間。通過融合一段增強區(qū)大大提高了持續(xù)合成能力，提高了PCR擴增速率，結(jié)合該酶的3’-5’核酸外切酶活性使得其保真性是普通Taq酶的數(shù)十倍。而該酶的dute結(jié)構(gòu)使其即便在有PCR抑制劑存在的情況下，也能快速有效的得到目的產(chǎn)物。
PV2 DNA 聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’核酸外切酶活性，PCR擴增產(chǎn) 物為平末端。
優(yōu)勢
l 保真度高：確保PCR復制的精確程度
l 快速：延伸時間短（15-30秒/kb）
l 方便：功能強勁，只需最少的優(yōu)化
l 高產(chǎn)量：用更少的酶，獲得更高的產(chǎn)量
應用
l 高保真PCR
l 快速PCR
l 高通量PCR
l 長片段或困難模板擴增
l 克隆
儲存條件
20mM Tris-HCl（pH7.4 @ 25°C），100 mM KCl，1 mM DTT，0.1mM EDTA，穩(wěn)定劑，50% 甘油
反應條件
50µl反應體系中含有：1X PV2緩沖液，DNA模板，0.5µM上下游引物，0.2mM dNTP，3% DMSO（可選），1U PV2 DNA聚合酶。
單位定義
一個單位 PV2 DNA聚合酶可在 74°C，在 30 分鐘內(nèi)向不溶于酸材料中摻入 10 nmol脫氧核糖核苷酸。
熱失活
無
PCR擴增反應建立
為了得到理想的PCR結(jié)果，我們建議所有的試劑使用前都要充分混勻并離心，整個反應操作在冰上進行，并迅速將反應轉(zhuǎn)移到預bianxing（98°C）的PCR循環(huán)儀上。為避免PV2 DNA 聚合酶3’-5’核酸外切酶活性引起的引物降解，PV2 DNA 聚合酶要最后加入到反應體系中。請注意，以下的操作步驟與其它標準聚合酶不同，因此以下推薦的反應條件為zuijia反應條件。
組分 | 20 µl 反應體系 | 50 µl反應體系 | 終濃度 |
5X PV2 緩沖液 | 4 µl | 10 µl | 1X |
10 mM dNTPs | 0.4 µl | 1 µl | 200 µM |
10 µM 正向引物 | 1 µl | 2.5 µl | 0.5 µM |
10 µM 逆向引物 | 1 µl | 2.5 µl | 0.5 µM |
模板 DNA | 可變 | 可變 | < 250 ng |
DMSO (optional) | (0.6 µl) | (1.5 µl) | 3% |
PV2 DNA 聚合酶Polymerase | 0.2 µl | 0.5 µl | 1.0 U/50 µl PCR |
ddH2O | to 20 µl | to 50 µl |
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注意：PCR反應建立后，將反應物吸打混勻，短暫離心將液體收集到管底。如果使用的PCR循環(huán)儀沒有加熱蓋，可在樣品上覆蓋礦物油。
將PCR管從冰上轉(zhuǎn)移至預加熱（bianxing溫度98°C）的PCR儀上開始熱循環(huán)
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 |
預bianxing | 98°C | 30 s |
25-35 Cycles | 98°C | 5-10 s |
終延伸 | 72°C | 5-10 min |
Hold | 4-10°C |
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PCR擴增反應指南
1. 模板:
使用高質(zhì)量、高純度的DNA模板可以提高PCR反應的成功率 。50ul反應體系建議的DNA模板用量建議如下：
DNA | Amount |
基因組 | 50 ng–250 ng |
質(zhì)?；虿《?/span> | 1 pg–10 ng |
如果DNA模板來自于cDNA合成反應，DNA的體積應該不超過總的反應體積的10%。
2. 引物:
寡核苷酸引物長度一般為20~40nt，GC含量一般為40~60%，可以使用Primer 5等軟件設計分析引物 。使用PV2 DNA聚合 酶時 ，每條引物的終濃度為0.2~1μM，建議用量是0.5μM。
3. Mg2+ 和添加劑:
由于PV2 DNA 聚合酶是一種鎂離子依賴型酶，故Mg2+濃度對其有著關鍵作用。在1X PV2緩沖液中Mg2+終濃度為1.5 mM。過量的Mg2+能穩(wěn)定DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，阻止DNAwanquanbanxing，以穩(wěn)定由于引物非正確結(jié)合模板位點引起的假陽性。zuijiaMg2+濃度應還受總dNTP的濃度、特定模板以及樣品緩沖液成分影響。如果引物或模板中含有像EDTA或EGTA等螯合劑時，則應提高Mg2+的濃度。如需進一步優(yōu)化， 可以使用MgCl2按0.5 mM濃度逐步提升調(diào)整。
對于復雜模板，如高GC含量的序列和帶有復雜二級結(jié)構(gòu)的序列，可以加入DMSO等添加劑提高反應效率。建議DMSO的終濃度為3%，也可以以2%的濃度遞增優(yōu)化。需要注意的是由于DMSO可以降低引物的Tm值 ，因此如果DMSO濃度很高， 則需要降低退火溫度。PV2 DNA聚合酶也可以與其它添加劑兼容，如：甲酰胺或甘油。
4. dNTP:
dNTP的反應終濃度通常是各200 μM 。在使用PV2 DNA聚合酶時，不推薦使用dUTP和帶有niaomiding的引物或模板。
5. PV2 DNA 聚合酶:
我們推薦PV2 DNA聚合酶的使用濃度是20 U/ml (1.0 U/50 μl 反應體系)。根據(jù)擴增子的長度和困難程度，可以對PV2 DNA聚合酶在10–40 U/ml (0.5–2 U/50 μl 反應體系) 之間進行優(yōu)化。50 µl反應體系中PV2 DNA聚合酶的用量不要超過2 U，尤其當擴增子的長度大于5 kb時。
6. 緩沖液:
隨酶提供5X PV2緩沖液。當進行高保真擴增時該緩沖液是默認的推薦緩沖液。
7. Bianxing:
我們推薦大多數(shù)模板的預bianxing溫度及時間是98°C 與 30s。對于需要延長bianxing時間的模板，預bianxing時間可以增加到3min。
在 PCR過程中，bianxing時間越短越好，大多數(shù)模板通常在98°Cbianxing時間是5~10s即可。
8. 退火:
與其它PCR聚合酶相比PV2 DNA 聚合酶需要較高的bianxing溫度 。PV2 DNA 聚合酶具有穩(wěn)定引物和模板雜交的性能，當引物長度大于20nt時，退火溫度在zuidiTm的基礎上加3°C復性10~30s；但當引物長度小于或等于20nt時，退火溫度為zuidi的Tm?？梢愿鶕?jù)需要建立溫度梯度去尋找引物和模板結(jié)合的zuishi溫度，這個梯度溫度以zuidi的Tm逐步提升到模板延伸溫度（兩步PCR）。
對于Tm較高的引物用兩步PCR法可以不需要復性這一步。
9. 延伸:
延伸過程在72°C進行，延伸時間取決于擴增片段的長度和模板復雜度，復雜度較低時可用15s/Kb的延伸時間；復雜度較高的基因組DNA模板，延伸時間則應為30s/Kb。對于有些cDNA模板，延伸時間可增加到40s/Kb。
10. 循環(huán)數(shù):
通常25~35個循環(huán)可以產(chǎn)生足夠的PCR產(chǎn)物。
11. 兩步法PCR:
當引物的退火溫度≥ 72°C 時建議使用兩步法進行PCR擴增。
常規(guī)的兩步法PCR熱循環(huán)條件如下：
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 |
預bianxing | 98°C | 30 s |
25-35 個循環(huán) | 98°C | 5-10 s |
終延伸 | 72°C | 5-10 min |
Hold | 4-10°C |
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12. PCR產(chǎn)物:
使用PV2 DNA聚合酶擴增的產(chǎn)物為平末端，如果產(chǎn)物用于克隆，建議使用平末端連接。如果需要進行T/A克隆，在加A之前需要純化DNA，因為PV2 DNA 聚合酶會降解產(chǎn)生的突出端。
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