自1986年di一個單抗藥物Ortholone OTK3上市，單抗藥物經(jīng)歷了鼠源、嵌合、人源化及全人源的發(fā)展歷程。但自始至終，藥物的單克隆性都是作為治療性單抗的第一要素。

　　作為單抗的生產(chǎn)者，細胞株的單克隆源性就成為了單抗藥物研發(fā)、生產(chǎn)的重中之重，是產(chǎn)品表達和質(zhì)量均一性的前提和保證。隨著30多年來的單抗藥物開發(fā)技術(shù)及工具的不斷發(fā)展，各國的FDA對細胞單克隆源性的規(guī)則和細節(jié)要求在不斷提高。

　　1、2011年以前，一般只需要兩輪的傳統(tǒng)稀釋即可。對代替手工分選或鋪板的設(shè)備，則主要關(guān)注這些工具的具體應(yīng)用流程和如何考察單克隆概率等。

　　2、在2012年，針對有限稀釋法，提出需額外提供泊松分布數(shù)據(jù)來證明所采用的有限稀釋法所得到單克隆的細胞株的統(tǒng)計學(xué)概率。

　　3、2013年，明確提出必須確認(rèn)WCB的單克隆源性。

　　4、2014年有FDA官員建議，借助成像方式來證明細胞的單克隆性，可允許一輪的有限稀釋。隨著單克隆成像儀的不斷應(yīng)用于細胞系開發(fā)，F(xiàn)DA的官員也充分認(rèn)識到該技術(shù)的可靠性及嚴(yán)謹(jǐn)性。

　　5、從2016年至今，單克隆成像配合有限稀釋法或者高效鋪板設(shè)備實現(xiàn)細胞株的開發(fā)的技術(shù)路線已成為全球眾多藥企的基本工藝方法。

　　為保證細胞株的單克隆驗證服務(wù)，一般會采用以下方法：

　　（1）兩輪有限稀釋。根據(jù)泊松分布的原理計算，按照低于0.5 cells/well進行兩輪優(yōu)先稀釋，理論單克隆率在95%以上，但是需要注意的是，有限稀釋法得到的單克隆是沒辦法證明為單克隆的，只能推定為單克隆；

　?。?）一輪有限稀釋或者單細胞鋪板設(shè)備搭配單克隆成像設(shè)備。不同于概率計算和統(tǒng)計，這個方法可以提供單克隆源性的影像數(shù)據(jù)，但同時面臨一定的挑戰(zhàn)。首先，需要考量細胞是否沉底，落孔后細胞的位置等；其次，成像設(shè)備的孔位校準(zhǔn)、微孔板底聚焦、光源、鏡頭位移、分辨率等都會影響圖像的準(zhǔn)確性和有效性。

　　因此，在項目開展前對單細胞鋪板以及單克隆成像的整套細胞株構(gòu)建工藝流程的可靠性進行一定的方法學(xué)驗證是非常有必要的。

　　從研發(fā)的細胞株工藝平臺搭建方面，單克隆源性方法學(xué)驗證后的流程更可控，確立好的SOP更易于執(zhí)行，極大地降低工藝開發(fā)的潛在風(fēng)險；當(dāng)項目走到申報階段，方法學(xué)驗證后的單克隆成像圖片嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)，挑戰(zhàn)更小，結(jié)合細胞庫均一性驗證的證明，達到雙重保險的目的，確保項目申報的細胞株構(gòu)建環(huán)節(jié)的內(nèi)容順利和快速的通過。

　　如何進行單克隆源性的方法學(xué)驗證：

　　方法學(xué)驗證需要基于每個公司的現(xiàn)有工藝平臺，如果選擇的工藝路線是兩輪有限稀釋，那么可以根據(jù)實際結(jié)果結(jié)合泊松分布來推算鋪板密度的合理性。如果選擇一輪有限稀釋或者單細胞鋪板設(shè)備搭配單克隆成像設(shè)備，那么就需要考慮鋪板后細胞沉底條件、細胞在孔板中位置以及單克隆成像設(shè)備對單克隆的識別能力。此外，基于單克隆鋪板設(shè)備的工藝平臺，還需要考量和評估不同項目的交叉污染風(fēng)險。

　　單克隆驗證服務(wù)的方法學(xué)驗證核心步驟：

　　細胞自然沉降工藝驗證采用明場成像，考察工藝平臺的宿主細胞在平臺沉降時間內(nèi)是否可以沉降，以及不同時間點沉降的效果。

　　離心沉降工藝驗證采用明場成像，考察平臺宿主細胞在平臺離心條件下是否可以沉降，以及離心后不同時間點沉降的效果。

　　細胞識別驗證采用明場和熒光場成像，考察成像設(shè)備對單克隆的識別情況。

　　單克隆鋪板設(shè)備項目交叉驗證采用明場和熒光場成像，考察不同項目間單克隆鋪板設(shè)備是否有細胞株交叉現(xiàn)象。

　　關(guān)于單克隆方法學(xué)驗證的實驗細節(jié)，歡迎聯(lián)系我們進行咨詢。