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Applied Biosystems™ 7300 和 7500 實(shí)時熒光定量PCR儀器入門指南：相對定量測定

貨號：4347824

實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）作為分子生物學(xué)研究中的一種強(qiáng)大工具，已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原體檢測、基因分型和藥物篩選等多個領(lǐng)域。賽默飛世爾科技旗下的Applied Biosystems™ 7300 和 7500系列實(shí)時熒光定量PCR儀器，憑借其出色的性能、簡便的操作和強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析能力，成為眾多實(shí)驗(yàn)室和研究機(jī)構(gòu)的。本文將為您詳細(xì)介紹這兩款儀器，并著重講解其在相對定量測定中的應(yīng)用。

一、Applied Biosystems™ 7300 和 7500 實(shí)時PCR儀器概述

Applied Biosystems™ 7300 和 7500 實(shí)時PCR儀器是專為滿足不同規(guī)模實(shí)驗(yàn)室需求設(shè)計(jì)的高性能設(shè)備。它們均集成了多通道熒光檢測、精準(zhǔn)溫度控制和直觀的數(shù)據(jù)分析軟件，能夠幫助科研人員進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的核酸定量分析。

1.1 7300 和 7500 系列的區(qū)別

• 7300 實(shí)時熒光定量PCR儀器：7300型號為中小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，適合需要中等通量的研究。其系統(tǒng)采用96孔板，適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)的定量分析。

• 7500 實(shí)時熒光定量PCR儀器：7500系列與7300的主要區(qū)別在于其優(yōu)化的速度和靈活性，能夠在更短的時間內(nèi)完成PCR反應(yīng)。7500可用于高通量實(shí)驗(yàn)，擁有更強(qiáng)的處理能力，特別適用于時間要求較高的實(shí)驗(yàn)室。

二、Thermo賽默飛實(shí)時熒光定量PCR儀器4347824：核心技術(shù)與特點(diǎn)

Applied Biosystems™ 7300 和 7500 系列實(shí)時熒光定量PCR儀器采用的核心技術(shù)確保了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的高靈敏度、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。以下是其幾大核心技術(shù)優(yōu)勢：

2.1 多通道熒光檢測

這兩款儀器均配備了多通道熒光檢測系統(tǒng)，7300 配有四通道檢測能力，而7500系列擁有五通道熒光檢測功能。多通道熒光檢測允許用戶在同一個反應(yīng)體系中檢測多種目標(biāo)基因，實(shí)現(xiàn)多重PCR的應(yīng)用。多重檢測極大地提高了實(shí)驗(yàn)的通量，同時節(jié)省了樣本量和反應(yīng)時間。

2.2 精確的熱循環(huán)系統(tǒng)

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵在于精確的熱循環(huán)控制。Applied Biosystems™ 7300 和 7500 實(shí)時PCR儀器內(nèi)置高精度溫度控制模塊，確保每個PCR反應(yīng)循環(huán)中的溫度變化均一且穩(wěn)定，減少了因溫度波動造成的實(shí)驗(yàn)偏差，從而提高了PCR反應(yīng)的重復(fù)性和可靠性。

2.3 用戶友好的操作界面

這兩款儀器均配備直觀易用的軟件界面，操作流程簡便。其專屬的qPCR軟件能夠自動化分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，支持多種分析模式，如絕對定量、相對定量、SNP分析和基因分型。即使是新手實(shí)驗(yàn)人員，也能夠迅速掌握儀器操作流程，完成數(shù)據(jù)采集與分析。

2.4 兼容多種化學(xué)試劑

7300 和 7500 系列儀器均支持多種熒光染料和探針化學(xué)試劑，如SYBR Green、TaqMan探針和分子信標(biāo)。這種廣泛的兼容性為用戶提供了高度靈活性，能夠根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求選擇最佳的試劑和反應(yīng)方案。

三、相對定量測定中的應(yīng)用

相對定量PCR是一種廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析的方法，通過與內(nèi)參基因的比較來確定目標(biāo)基因的相對表達(dá)水平。以下是Applied Biosystems™ 7300 和 7500 實(shí)時PCR儀器在相對定量測定中的應(yīng)用方法和流程。

3.1 相對定量的原理

相對定量測定基于△△Ct方法（雙重循環(huán)閾值比較法），其中Ct值代表PCR擴(kuò)增達(dá)到熒光信號閾值所需的循環(huán)數(shù)。通過比較目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的Ct值差異，可以計(jì)算目標(biāo)基因在不同實(shí)驗(yàn)條件下的相對表達(dá)水平。

相對定量的計(jì)算公式為：

$$\text{相對表達(dá)量} = 2^{-\Delta \Delta Ct}$$

其中：

• $\Delta Ct = Ct_{\text{目標(biāo)基因}} - Ct_{\text{內(nèi)參基因}}$

• $\Delta \Delta Ct = \Delta Ct_{\text{實(shí)驗(yàn)組}} - \Delta Ct_{\text{對照組}}$

該方法能夠精準(zhǔn)反映基因表達(dá)在不同實(shí)驗(yàn)條件下的變化，適用于比較多個樣本或?qū)嶒?yàn)條件下的基因表達(dá)差異。

3.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1. 樣本準(zhǔn)備

在相對定量PCR實(shí)驗(yàn)中，首先需要從實(shí)驗(yàn)樣本（如組織或細(xì)胞）中提取高質(zhì)量的RNA，然后通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，RNA樣本必須保持純凈，避免蛋白質(zhì)、DNA或有機(jī)溶劑的污染。

2. qPCR反應(yīng)體系配置

使用Applied Biosystems™ 7300 或 7500儀器，qPCR反應(yīng)體系通常包括：

• 目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的引物

• cDNA模板

• 熒光探針（如TaqMan探針）或SYBR Green染料

• PCR酶和緩沖液

確保引物設(shè)計(jì)合理，能夠特異性擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的片段，同時引物退火溫度優(yōu)化到最佳，以提高反應(yīng)的擴(kuò)增效率。

3. 設(shè)置實(shí)驗(yàn)條件

在Applied Biosystems™ 7300 或 7500系統(tǒng)中，用戶可以輕松設(shè)置PCR循環(huán)參數(shù)，包括預(yù)變性、退火和延伸步驟。根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化情況調(diào)整退火溫度和循環(huán)次數(shù)，確保高效的擴(kuò)增。

4. 數(shù)據(jù)采集與分析

qPCR反應(yīng)完成后，系統(tǒng)會自動生成Ct值。通過內(nèi)置的軟件，用戶可以輕松地利用△△Ct方法進(jìn)行相對定量分析。數(shù)據(jù)分析過程中，需確保內(nèi)參基因的Ct值在不同樣本間保持相對穩(wěn)定，才能確保相對定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.3 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化與內(nèi)參基因選擇

在相對定量PCR實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化是非常關(guān)鍵的一步。通常使用內(nèi)參基因來校正樣本間的差異，常見的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-Actin和18S rRNA等，這些基因在不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)通常保持穩(wěn)定。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時，選擇適合的內(nèi)參基因能夠顯著提高相對定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

四、Thermo賽默飛實(shí)時熒光定量PCR儀器4347824：應(yīng)用實(shí)例

4.1 基因表達(dá)研究

在基因表達(dá)分析中，Applied Biosystems™ 7300 和 7500 實(shí)時PCR系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于檢測特定基因在不同組織、發(fā)育階段或?qū)嶒?yàn)條件下的表達(dá)水平。例如，在癌癥研究中，科研人員可以利用這些儀器分析腫瘤組織中與癌癥相關(guān)基因的表達(dá)變化，揭示潛在的分子機(jī)制。

4.2 病原體檢測

7300 和 7500 系列儀器在病原體檢測方面表現(xiàn)優(yōu)異，尤其是在病毒或細(xì)菌核酸檢測中。相對定量方法能夠幫助臨床研究人員量化病原體的感染水平，為疾病診斷和防控提供有力的支持。

4.3 藥物篩選與毒性評估

在藥物篩選過程中，研究人員經(jīng)常使用7300 和 7500 實(shí)時PCR系統(tǒng)分析藥物處理后細(xì)胞中基因表達(dá)的變化，以評估藥物的效果和毒性。這種應(yīng)用尤其適用于高通量篩選研究，通過多重qPCR檢測多個基因，快速評估藥物對不同基因的調(diào)控作用。

五、優(yōu)勢與應(yīng)用前景

5.1 高靈敏度與高特異性

Applied Biosystems™ 7300 和 7500 實(shí)時PCR系統(tǒng)的高靈敏度能夠檢測到微量的核酸，并精確量化其表達(dá)水平。這在分析低豐度基因表達(dá)時尤為重要，能夠提供可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 多重檢測與高通量應(yīng)用

多重?zé)晒鈾z測功能使得7300 和 7500 系列能夠在一次反應(yīng)中同時檢測多個基因，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率，減少了樣本和試劑的用量。