LBA4404 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞

產(chǎn)品信息：

組成                                    BC301-01                                                                  
LBA4404 Chemically Competent Cell                            20×100μl  
pCAMBIA2301（100ng/μl）                    1 支  
   
儲存條件：-70℃保存，避免反復凍融。  
基因型：  
Ach5 (rif R ) Ti pAL4404 (StrR ) Octopine  
產(chǎn)品介紹：  
LBA4404 菌株為 Ach5 型背景，核基因中含有篩選標簽——抗性基因 Rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此  
菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的章魚堿型 Ti 質(zhì)粒 pAL4404，此質(zhì)粒含有 vir 基因（vir 基因是 T-DNA 插入植物基  
因組必需的元件，pAL4404 質(zhì)粒自身的 T-DNA 轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體 T-DNA 順利轉(zhuǎn)  
移）。pAL4404 型 Ti 質(zhì)粒含有篩選標簽：Strep，賦予 LBA4404 菌株抗性，適用于菸草、番茄、煙草等  
植物的轉(zhuǎn)基因操作，經(jīng)植物雙元 pCAMBIA2301 質(zhì)粒檢測，轉(zhuǎn)化效率可達 10 3 cfu/μg，-70℃保存 12 個月轉(zhuǎn)化  
效率不發(fā)生改變。  
轉(zhuǎn)化方法  
（采用凍融方法）  
1. 取-70℃保存的 LBA4404 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞于冰水浴中融化；  
2. 無菌條件下，向感受態(tài)細胞中加入 100ng-1μg 質(zhì)粒 DNA（次使用前做預實驗確定所加質(zhì)粒的  
量），輕輕混勻，冰水浴中靜置 5 分鐘；  
3. 將離心管置于液氮中速凍 5 分鐘；（注：也可以用干冰和無水乙醇混合物代替液氮）  
4. 然后快速將離心管置于 37℃水浴中保持 5 分鐘，不要晃動水面；  
5. 將離心管放回冰水浴中，冰浴 5 分鐘；  
6. 無菌條件下加入 800μl 無抗生素的 2xYT 或 LB 液體培養(yǎng)基，于 28℃振蕩培養(yǎng) 2~3 小時，菌體復蘇；  
7. 6000rpm 離心 1 分鐘收菌，留 100μl 左右上清，輕輕吹打重懸菌體，取適量菌液，涂布于相應抗生素的  
LB 平板上，于 28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 48-72 小時。  
（當平板只含有 50 μg/ml Kan 時，28℃培養(yǎng) 48 h 即可；平板中同時加入 50 μg/ml Kan，20 μg/ml Rif 時，需 28℃  
培養(yǎng) 60 h；如果使用的平板含有 50 μg/ml Rif 則需要 28℃培養(yǎng) 72-90 h）。  
注意事項  
1. 加入質(zhì)粒時體積不應大于感受態(tài)體積的 1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；  
質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。  
2. 混入質(zhì)粒時應輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應減少最終用于涂板的菌量。  
3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應  
減少質(zhì)粒用量。  
4. 濃度不應高于 25 μg/ml，過高的濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。  
5. 培養(yǎng)基中加入的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入 Ti 質(zhì)粒篩選抗生素  
可防止 Ti 質(zhì)粒丟失，但 Ti 質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮  
這些抗生素，Ti 質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。