CRISPR/Cas9動物模型構(gòu)建
- 公司名稱 上海達為科生物科技有限公司
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- 更新時間 2025/7/9 13:07:09
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制作動物模型 細胞培養(yǎng) 分子生物學檢測 病理學形態(tài)檢測 蛋白質(zhì)技術(shù) 免疫學檢測 提供培訓服務(wù)各種檢驗儀器設(shè)備、玻璃儀器及器具、一次性耗材等
一、技術(shù)原理與核心突破
CRISPR/Cas9系統(tǒng)源于細菌適應(yīng)性免疫機制，通過雙RNA引導實現(xiàn)靶向DNA切割：
引導機制：
crRNA（CRISPR RNA）識別靶序列，tracrRNA（反式激活crRNA）激活Cas9酶，兩者可融合為sgRNA（單鏈引導RNA）。
PAM序列（5'-NGG-3'）是Cas9切割的必要位點，位于靶基因下游。
切割模式：
Cas9的HNH結(jié)構(gòu)域切割互補鏈，RuvC-like結(jié)構(gòu)域切割非互補鏈，形成雙鏈斷裂（DSB）。
修復(fù)路徑：
非同源末端連接（NHEJ） ：易產(chǎn)生插入/缺失突變（Indels），導致基因敲除。
同源定向修復(fù)（HDR） ：需提供同源修復(fù)模板（ssODN或載體），實現(xiàn)精準插入或點突變。
革命性突破：CRISPR/Cas9shou次實現(xiàn)哺乳動物細胞的高效、可編程基因編輯，且支持多靶點同步編輯。
二、動物模型構(gòu)建策略與技術(shù)優(yōu)化
（一）核心操作流程
（二）關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)
| 步驟 | 關(guān)鍵操作 | 優(yōu)化方案 |
|---|---|---|
| sgRNA設(shè)計 | 靶向基因外顯子區(qū)，避開脫靶位點（工具：CRISPRscan） | 添加5'端G增強轉(zhuǎn)錄效率 |
| 編輯組件遞送 | - mRNA注射：Cas9 mRNA + sgRNA（小鼠受精卵） - 蛋白注射：Cas9-sgRNA核糖核蛋白（RNP） | RNP減少脫靶效應(yīng) |
| 同源重組增強 | 聯(lián)合注射ssODN（單鏈寡核苷酸）及重組增效劑（如RS-1） | RS-1提升HDR效率3-5倍 |
| 胚胎移植 | C57BL/6品系受精卵 → 假孕母鼠（ICR或BALB/c） | 移植存活率>60% |
（三）模型類型與構(gòu)建效率
| 模型類型 | 構(gòu)建方法 | 周期 | 效率 | 案例 |
|---|---|---|---|---|
| 基因敲除（KO） | NHEJ修復(fù)誘導移碼突變 | 3-4個月 | 80% F0代突變 | 免疫缺陷鼠（Rag2/IL2rg雙敲） |
| 點突變模型 | HDR修復(fù)+ssODN模板 | 4-6個月 | 20-40% | 阿爾茨海默?。╰au-V337M） |
| 條件性敲除 | 雙sgRNA靶向flox區(qū)域 + Cre小鼠雜交 | 6-8個月 | 50% F1代重組 | 肺癌模型（LoxP-Kras/p53） |
| 大片段敲入 | BAC載體同源重組 + CRISPR切割 | >8個月 | 10-15% | 人類疾病基因人源化模型 |
三、疾病模型應(yīng)用與前沿案例
（一）腫瘤模型
肝癌：
同步靶向肝細胞抑癌基因 PTEN 和 P53，8周內(nèi)誘發(fā)肝癌。
腦瘤：
多基因編輯（Ptch1/Trp53/Pten/Nf1）構(gòu)建成神經(jīng)管細胞瘤模型。
肺癌：
組織特異性模型：條件性Cas9小鼠 + AAV9遞送sgRNA（靶向Kras/p53/Lkb1），實現(xiàn)肺組織特異性致癌。
（二）遺傳病模型
| 疾病 | 靶基因 | 表型特征 | 研究價值 |
|---|---|---|---|
| 白化病 | 酪an酸酶（Tyr） | 毛發(fā)/視網(wǎng)膜色素缺失 | 基因治療載體驗證 |
| 威爾遜病 | ATP7B | 銅代謝障礙→肝損傷 | 基因修復(fù)療法測試 |
| 血友病乙 | F9（凝xue因子Ⅸ） | 出血傾向 | 體內(nèi)基因編輯療效評估 |
（三）神經(jīng)與代謝疾病
阿爾茨海默病：
MAPT突變模型：CRISPR/Cas9編輯小鼠tau蛋白基因，模擬神經(jīng)纖維纏結(jié)。
糖尿病：
db/db小鼠改良：CRISPR精準引入Lepr突變，縮短模型構(gòu)建周期至12周。
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