雙特異性抗體（bispecific antibody,BsAb）是指含有兩種特異性抗原結(jié)合位點的人工抗體，可以同時與靶細胞和功能細胞進行相互作用，進而增強腫瘤細胞殺傷功能。近年，雙抗迎來研發(fā)熱潮，截至2024年底，全球已有19款雙抗藥物獲批上市，在研雙抗藥物數(shù)量達數(shù)百款。雙抗主要通過基因重組技術(shù)進行生產(chǎn)，有多種多樣的分子設(shè)計類型，滿足雙抗分子識別兩種不同抗原的能力。
其中IgG-like 的雙特導(dǎo)性抗體在表達中，理論上會伴隨產(chǎn)生10種以上的副產(chǎn)物，主要包括重鏈之間錯配引起的同源抗體（homodimer Fc species）輕鏈與重鏈之間錯配引起的異源抗體（heterodimeric Fc species）結(jié)構(gòu)不完整的片段抗體、如半抗（half antibody）或3/4抗體、以及輕鏈聚集體（light chain dimer）重鏈聚集體（heavy chain dimer）等等。參見示意圖1。
圖1. 雙特異性 mAb 表達中輕重鏈區(qū)域的可能組合
科學(xué)家們已經(jīng)找出多種巧妙的分子設(shè)計策略來降低上述副產(chǎn)物的產(chǎn)生。其中，經(jīng)典的要屬降低重鏈同源錯配的 KiH，即 Knob-into-hole 技術(shù)，以及降低輕鏈重鏈錯配的 CrossMab 技術(shù)。然而，所有分子設(shè)計策路都只能盡量降低某類副產(chǎn)物的產(chǎn)生，而不能消除全部的副產(chǎn)物。不僅如此，在雙抗的重組表達過程，還不可避免的會產(chǎn)生不完整的片段抗體以及聚集體。所有這些都給雙抗分子的下游工藝開發(fā)提出了挑戰(zhàn)。
面對這個問題，Biozen dSEC2色譜柱嘗試通過對一種lgG-like類型雙抗分子（Vudalimab）進行純度分析，嘗試分離幾類主要的副產(chǎn)物，比如homodimer, half antibody, light chain related impurity aggregate 等[1]。
Vudalimab （分子量約 125.43 kDa）是一種YBODY®平臺工藝生產(chǎn)的二價（1:1）非對稱性的結(jié)構(gòu); 具體為靶向抗原A的單元Fab-Fc和靶向抗原B的單鏈單元ScFv-Fc 組成 (Fab-ScFv-Fc) （參見圖2）。單元A和單元B在二者Fc-CH3之間通過鹽橋（Salt-Bridge）和“杵入臼"（Knob-into-Hole）等工程改造以有效形成目標雙抗體（heterodimer），并在鉸鏈區(qū)（hinge region）形成穩(wěn)定的鏈間二硫鍵。這些對Fc 的工程改造大大提高了目標雙抗分子的占比，保證了雙抗體生產(chǎn)的高產(chǎn)率以及工藝和產(chǎn)品的穩(wěn)定性。
圖2. Vudalimab PD-1 × CTLA-4 雙抗示意圖[2]
在Biozen dSEC-2（3um，7.8x300mm） 色譜柱上的分析結(jié)果可見：通過和蛋白標準品對比，Vudalimab的洗脫時間略晚于分子量150kDa的human IgG的洗脫時間；放大看Vudalimab的HMWS部分可以看到有至少三種不同分子量分布。推測為Homodimer錯配，目標雙抗聚集體和Homodimer的聚集體等。參見圖3。
圖3. Vudalimab的聚集體和Aqueous SEC check standard的疊圖
Biozen dSEC-2的高親水性改性的硅膠修飾技術(shù)結(jié)合鈦合金的柱硬件使得和生物大分子的次級作用得到改善，另外，dSEC-2有的孔控制技術(shù)也使得這款色譜柱具有柱床穩(wěn)定，耐壓，批次重現(xiàn)性好的特點。
參考文獻
[1]. Cytiva：雙抗的純化策略
[2]. Mark N. Stein, et, al. A Phase 2 Study of Vudalimab, a PD-1 × CTLA-4 Bispecific Antibody, Plus Chemotherapy or Targeted Therapy in Patients with Molecularly Defined Subtypes of Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer.
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