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一種高通量RNA結(jié)構(gòu)測(cè)定方法
點(diǎn)擊次數(shù)：2922 發(fā)布時(shí)間：2010-12-29
一種高通量RNA結(jié)構(gòu)測(cè)定方法
《自然—方法學(xué)》近日刊文，描述了一種高通量RNA結(jié)構(gòu)測(cè)定方法——“片段化測(cè)序”法（Fragmentation sequencing ，F(xiàn)ragSeq）。
RNA對(duì)基因表達(dá)和基因組穩(wěn)定性的調(diào)控作用成為近來(lái)研究的熱點(diǎn)，而弄清RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)是理解RNA功能的*個(gè)必要步驟。測(cè)定非編碼RNA結(jié)構(gòu)的經(jīng)典方法是化學(xué)法和酶法，但是它們一次只能測(cè)定一個(gè)RNA分子，這種方法不僅費(fèi)力而且對(duì)技術(shù)要求高。FragSeq法卻可以在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平同時(shí)對(duì)大量RNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定。
該研究利用核酸酶P1將小鼠RNA進(jìn)行片段化，得到20–100-nt 大小片段；之后在片段的5"-PO4和3"-OH端分別加上接頭，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增之后，構(gòu)建FragSeq文庫(kù)并對(duì)其進(jìn)行深測(cè)序。為了保證文庫(kù)片段均是由核酸酶P1剪切產(chǎn)生，薩拉馬等設(shè)置了兩個(gè)對(duì)照組：一組RNA不使用核酸酶P1處理來(lái)估算由內(nèi)源降解產(chǎn)生5"-PO4基團(tuán)的片段數(shù)，另一組則多加了T4連接酶處理RNA，以此來(lái)計(jì)算不產(chǎn)生5"-PO4基團(tuán)的片段數(shù)。通過(guò)凝膠電泳分離出目標(biāo)片段。zui后薩拉馬等利用一種軟件，可以將大量測(cè)序結(jié)果格式化，使其能夠被一種RNA預(yù)測(cè)軟件讀取，進(jìn)而預(yù)測(cè)出RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。
相關(guān)研究由美國(guó)加州大學(xué)圣克魯茲分?；羧A德·休斯醫(yī)學(xué)研究院教授索菲·薩拉馬（Sofie Salama）所領(lǐng)導(dǎo)的課題組完成。