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石蠟及冰凍切片的制備(轉(zhuǎn))

時間:2011/6/22閱讀:3001
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◆ 標(biāo)本收集
    對于石蠟包埋的組織,活檢或手術(shù)切除標(biāo)本應(yīng)在2小時內(nèi)取材或固定,避免組織自溶及抗原變性等影響免疫組化結(jié)果。對于冰凍切片的組織,取材后應(yīng)立即放入液氮冷凍,然后放入-80℃保存。取材時應(yīng)保持所檢標(biāo)本原有的結(jié)構(gòu)、形態(tài),為避免擠壓組織,盡量使用鋒利刀片,并且避開壞死組織,除取病灶或含待檢抗原部位外,還應(yīng)取病灶與正常交界處,即所取組織切片中同時應(yīng)有抗原陽性和陰性區(qū),以形成自身對照。

◆ 常用固定液
    1.單純固定液

    ● 4%中性甲醛固定液:zui常用的固定液,能滿足常規(guī)HE及免疫組化、PCR等工作。一般無特殊要求的病理標(biāo)本均適用。尤其值得注意的是,中性甲醛是以pH 7.2~7.4的磷酸緩沖液為溶劑配制的,其固定效果及對組織抗原性的保存均優(yōu)于一般的4%甲醛固定液。此固定液配制后應(yīng)密封并保存在陰涼處,保存時間不超過一個月。
    --甲醛(40%)  100 ml
    --無水磷酸氫二鈉  6.5 g
    --磷酸二氫鈉  4.0g
    --蒸餾水 900 ml
    ● 乙醇固定液:使用時以80%~95%的濃度為宜,具有硬化、固定、脫水等作用,對組織滲透力較弱,因此很少單獨使用,但其保存組織中的核酸強(qiáng)于中性甲醛,故常用于有核酸操作的實驗或檢查,如果用于證明尿酸結(jié)晶和保存糖原,可用100%乙醇固定組織。
    ● 4%的多聚甲醛:主要用于培養(yǎng)細(xì)胞的固定,動物灌注固定及后固定(動物器官經(jīng)該液灌注后,然后取材,再用該液浸泡2~24小時)也常選該固定液固定。

    2.混合固定液
    ● 乙醇一甲醛(乙醇-福爾馬林,AF)固定液:適用于皮下組織中肥大細(xì)胞的固定。該固定液有固定兼脫水作用,固定后的標(biāo)本可直接入95%乙醇脫水。
    --甲醛(40%)  100 ml
    --95%乙醇  900 ml
    ● B5(醋酸鈉-升汞-甲醛)固定液:多用于固定淋巴組織。染色前應(yīng)進(jìn)行脫汞沉淀處理。
    --無水醋酸鈉  1.25 g
    --升汞 6.0 g
    --蒸餾水 90 ml
    --使用前加入甲醛 10 ml
    ● Bouin固定液:特別適用于睪丸活檢組織的固定。Bouin液對組織固定較均勻,收縮很少,不會使組織變硬變脆。需現(xiàn)配現(xiàn)用。
    --飽和苦味酸水溶液(約1.22%) 75 ml
    --甲醛 25 ml
    --冰醋酸 5 ml
    ● Carnoy固定液:穿透能力強(qiáng),可很好的固定細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,特別適合于固定外膜致密的組織,亦適用于糖原及尼氏小體的固定。
    --無水乙醇 60 ml
    --氯仿 30 ml
    --冰醋酸 10 ml
    ● Zenker固定液:經(jīng)此液固定的標(biāo)本,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色頗為清晰,但成本較昂貴且需特殊處理汞。該固定液要避免接觸陽光,以免引起化學(xué)變化而失效。
    --升汞 5.0 g
    --重鉻酸鉀 2.5 g
    --硫酸鈉 1.0g
    --蒸餾水(加至) 100 ml

◆ 蠟塊制備
    ● 固定(對于石蠟包埋的組織,一般用4%的多聚甲醛固定液。對于冰凍組織,一般采用冰凍丙酮,但對于不同的組織和抗原,可選用不同的固定液,應(yīng)根據(jù)具體情況而定);
    ● 脫水浸蠟(75%乙醇90~120min,85%乙醇90min,95%乙醇Ⅰ40min,95%乙醇Ⅱ40min,,無水乙醇Ⅰ30min,無水乙醇Ⅱ30min,二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min(可視觀察結(jié)果而定),石蠟Ⅰ60min,石蠟Ⅱ60min);
    ● 包埋(鐵板架包埋或其他容器,有時要求快速冷卻。)

◆ 石蠟切片
    連續(xù)切片,切片厚2~4μm,按序貼在玻片的下1/3。52~60℃烤片18h。切片可在4℃保存數(shù)年(石蠟切片)。

◆ 冰凍切片
    將術(shù)中送檢組織取材后,置于恒冷箱冰凍切片機(jī)切片架上,待組織塊冷凍變硬后切片,厚度為3~7μm。將切片貼附在載玻片上,空氣中稍風(fēng)干(1~2min),后放入固定液中固定。

 

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