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考馬斯亮藍(lán)

時間:2014/3/27閱讀:1355
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考馬斯亮藍(lán)coomassie brilliant blue一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)濃度成正比,因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。

考馬斯亮藍(lán)有G-250和R-250兩種。

考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色,zui大光吸收在465nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?,蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有zui大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比。R-250與蛋白質(zhì)反應(yīng)雖然比較緩慢,但是可以被洗脫下去,所以可以用來對電泳條帶染色。

染色————————————————————————————————————

蛋白質(zhì)與G-250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達(dá)到平衡,完成反應(yīng)十分迅速;其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立,試劑配制簡單,操作簡便快捷,反應(yīng)非常靈敏,靈敏度比Lowry法還高4倍,可測定微克級蛋白質(zhì)含量,測定蛋白質(zhì)濃度范圍為0~1 000μg/mL,是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。

 

有G-250和R-250兩種。其中G-250由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)十分迅速,常用來作為蛋白質(zhì)含量的測定。R-250與蛋白質(zhì)反應(yīng)雖然比較緩慢,但是可以被洗脫下去,所以可以用來對電泳條帶染色。

測定含量————————————————————————————————————

簡介

該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較的,但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0.2%影響測定結(jié)果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。常用于細(xì)胞骨架的檢驗。

濃染液

將100mgG-250溶于50mL 95%乙醇,加入100mL濃磷酸,然后,用蒸餾水補充至200mL,此染液放4℃至少6個月保持穩(wěn)定。

樣本準(zhǔn)備

盡量使用與待測樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品,例如測定抗體,可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)。如果待測樣本是未知的,也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。通常在20μg—150μg/100μL之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

溶解

將待測樣本溶于100~1緩沖溶液中,該緩沖溶液應(yīng)與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的緩沖溶液相同(用PBS)。

稀釋

按1:5用蒸餾水稀釋濃染料結(jié)合溶液,如出現(xiàn)沉淀,過濾除去。

作用

每個樣本加5mL

稀釋的染料結(jié)合溶液,作用5~30min。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后,將由紅色變?yōu)樗{(lán)色,在595nm波長下測定其吸光度。注意,顯色反應(yīng)不得超過30min.

計算

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣本的濃度。

處理方法————————————————————————————————————

 

和皮膚中蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合,反應(yīng)快速,并且穩(wěn)定,無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右,皮屑細(xì)胞自然衰老脫落即可無礙。

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