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雌二醇的制備方法

時間:2022/11/17閱讀:1135
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制備方法:

采用人骨髓來源細胞使用化合物三甲基膽蒽(MCA)誘導(dǎo)產(chǎn)生并篩選出細胞,并使用該細胞在體外合成性雌二醇;所述細胞已由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏號CCTCC C2012173;

制備步驟為:

1)人骨髓來源細胞(HMBDCs,主要成分為人骨髓間充質(zhì)干細胞)采用現(xiàn)有技術(shù)(本實施例采用骨髓沖洗、貼壁法)進行原代培養(yǎng)制備,制備的細胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為37℃,5%CO2,直至105個細胞/培養(yǎng)瓶;

2)培養(yǎng)基中加入MCA,使其終濃度為1ug/ml,并每星期更換含MCA的培養(yǎng)基2次;MCA處理1周后結(jié)束;細胞在37℃,5%CO2環(huán)境中,持續(xù)常規(guī)培養(yǎng);

3)培養(yǎng)至3個月,培養(yǎng)物中可見細胞中出現(xiàn)生殖細胞樣細胞;上述生殖細胞樣細胞表達生殖細胞的標志物:Oct4、Nanos3、c-Kit、DAZL、Vasa;

4)培養(yǎng)液中檢測到雌二醇的持續(xù)表達,與未經(jīng)誘導(dǎo)處理hBMDCs(E2=65±14.8pmol/L, n=6)相比,MCA誘導(dǎo)后hBMDCs中(E2=3243±947 pmol/L, n=6)雌二醇的濃度高達50倍(p<0.01)差異有顯著性;重新傳代后,觀察到隨著培養(yǎng)時間的延長,雌二醇濃度進行性增加,傳代培養(yǎng)至10天左右達到高峰,高達4500pmol/L,隨后逐步下降,最終維持到較高水平;

5)體內(nèi)雌二醇是由卵巢中卵泡合成,在體外培養(yǎng)的誘導(dǎo)后hBMDCs中,觀察到卵泡樣結(jié)構(gòu)的形成(為誘導(dǎo)后hBMDCs中產(chǎn)生雌激素提供細胞支持);卵母細胞的發(fā)育需雌二醇的促進,若缺乏雌二醇,卵母細胞的最大只能長到25微米;而誘導(dǎo)后hBMDCs中的卵母細胞樣細胞體積達到40-50微米;免疫熒光證實上述大細胞為卵母細胞;

6)卵泡相關(guān)基因,包括雌二醇合成的關(guān)鍵性基因:STAR、p450arom、p450c17,以及卵泡發(fā)育相關(guān)基因GDF9在培養(yǎng)物中表達(進一步支持誘導(dǎo)后hBMDCs具有合成雌二醇的能力);

7)優(yōu)化培養(yǎng)條件,增加雌二醇產(chǎn)生的能力,并降低培養(yǎng)液中血清的濃度(有利于雌二醇的進一步分離純化);上述生殖細胞樣細胞可進一步增大產(chǎn)生早期卵泡樣結(jié)構(gòu)和卵母細胞樣細胞;

8)按現(xiàn)有方法分離、純化,制得雌二醇。

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