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技術(shù)文章

膠回收常見問題及對策

閱讀:1922          發(fā)布時間:2010-12-9

1. 沒有回收到DNA片段
如在洗脫后,發(fā)現(xiàn)洗脫液中沒有DNA 片段,請檢查是否按瓶身標簽,在洗滌液中加入了無水乙醇。
 

2. 提取率低
1) 融膠液為酸性緩沖液,如融膠后,其pH 值升高將影響提取得率。請加入0.1 倍體積的3M 乙酸鉀(pH5.0)。
2) 長時間使用后沒有更換的電泳緩沖液,其pH 值較高,將影響DNA 的吸附。請更換新的電泳緩沖液后,再進行電泳,然后切膠。
3) 回收片斷大小影響回收效率(見下圖);
4) 在洗脫前,將洗脫液于30~60℃溫浴,可提高提取效率適當延長洗脫時間可增加回收效率。
5) 正確估計膠大小,確保加入足夠量的Binding Buffer;使膠*融解;
6) 提高Binding Buffer用量可提高小片斷DNA回收效率.對于<100bp的DNA片斷,可加入6倍體積的Binding Buffer;

3. 吸光度測量結(jié)果問題
吸光度測量的是未知樣品與調(diào)零標準之間的相對吸光度,所以請用與洗脫液體相同的液體,對測量樣品進行稀釋和調(diào)零。

4.如何計算提取率
1) 由于回收前樣品中,往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等,所以不能用測回收前后吸光度的的方法計算回收率。
2) 可將回收前后DNA 片段一起電泳,使用凝膠成像系統(tǒng)拍照后,用配套的軟件進行電泳條帶灰度對比。
3) 注意,電泳條件及拍攝條件將對灰度對比結(jié)果造成很大影響,請仔細操作,以減小誤差。

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