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    （1） 加入核酸探針，使與固定于尼龍膜上的特定RNA 進行雜合反應(yīng)，及

    （2） 待雜合反應(yīng)結(jié)束后以含鹽緩沖液與SDS 洗掉非專一性結(jié)合于尼龍膜上的核酸探針。 進行反應(yīng)時應(yīng)注意下列幾個問題：

    （1） 實驗操作過程仍應(yīng)盡可能避免RNase 的污染；

    （2） 反應(yīng)前應(yīng)先進行雜合前置反應(yīng)（prehybridization），以便減少核酸探針與尼龍膜的間的非專一性結(jié)合反應(yīng)；

    （3） 如果所使用的核酸探針是以random priming 或PCR 等方法所制備的雙股DNA 探針，使用前務(wù)必先加熱變性；

    （4） 選用適當(dāng)?shù)膰?yán)苛度 （stringency） 進行雜合反應(yīng)及后續(xù)的轉(zhuǎn)印膜漂洗工作，以便增強雜合反應(yīng)訊息，并減少噪聲，這主要可以從溫度與鹽濃度兩個方面加以考量。

 

    儀器用具：Crosslinker （Stratalinker 1800, Stratagene）；塑料盒；平端鑷子；封口機；42℃恒溫槽；60℃恒溫槽

 

    藥品試劑：6×SSC （0.9 M NaCl, 90 mM sodium citrate）尼龍膜；Hybridization solution [formamide, 50% （v/v）; 5×SSC; blocking reagent, 2% （w/v）;N-lauroylsarcosine, 0.1% （w/v）; SDS, 0.02% （w/v）]3MM 濾紙；2×SSC, 0.1% SDS；0.1×SSC, 0.1% SDS

 

    方法步驟：

    1） RNA 轉(zhuǎn)印步驟結(jié)束后，移除電泳膠上的吸水紙與3M 濾紙。

    2） 把尼龍膜連同電泳膠一齊移置于干凈衛(wèi)生紙上，并請小心維持電泳膠與尼龍膜的相對位置。

    3） 以防水筆在尼龍膜上標(biāo)出電泳膠樣本孔的位置，并以剪刀剪掉尼龍膜左上角，以便標(biāo)記電泳膠的左右方位。

    4） 小心地拉開尼龍膜，將的放置于6×SSC （20 mL） 浸泡5 min。

    5） 以平端鑷子夾起尼龍膜，待6×SSC 滴干的后，把尼龍膜平放于衛(wèi)生紙上，風(fēng)干至少30 min。與電泳膠接觸的那一面應(yīng)朝上。

    6） 以Stratalinker 1800 進行uv 連結(jié)反應(yīng)。

    7） 雜合前置反應(yīng)：

    a） 將10 mL 雜合溶液注入一個塑料袋。

    b） 把已經(jīng)風(fēng)干的尼龍膜移置于塑料袋內(nèi)，小心地把氣泡移除的后，以封口機密封好，再移至42℃恒溫槽進行雜合前置反應(yīng)1~2 h。

    8） 核酸探針變性反應(yīng)：

    a） 以微量移液器小心地把PCR 產(chǎn)物移至新的微量離心管。

    b） 將裝著核酸探針的微量離心管放入沸水中加熱10 min。請記得以夾子固定微量離心管的蓋子，以免加熱時蓋子爆開。

    c） 把離心管移入冰浴里靜置3 min。

    d） 瞬間離心后，取出已被變性的核酸探針，加到5 mL 的雜合溶液。

    9） 雜合反應(yīng)：

    a） 剪開塑料袋一角，倒出塑料袋內(nèi)雜合前置反應(yīng)所使用的溶液，并加入新配的含有核酸探針的雜合溶液 （8-d）。

    b） 小心移除氣泡，并以封口機密封塑料袋。

    c） 如前節(jié)所述將塑料袋移至42℃恒溫槽，雜合反應(yīng)將進行過夜。

    10） 以含鹽緩沖液與SDS漂洗轉(zhuǎn)印膜 （Northern blot）：

    a） 拿出塑料袋，塑料方盒以清水沖洗干凈的后，裝入80 mL [2×SSC, 0.1%SDS]。 剪開塑料袋，把尼龍膜取出放進 [2×SSC, 0.1% SDS]，于室溫漂洗2 次，每次5 min。

    b） 續(xù)以100 mL [0.1×SSC, 0.1% SDS] 于60℃洗2 次，每次15 min。溶液需先置于60℃恒溫水槽中預(yù)熱。