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公司動(dòng)態(tài)

以DIG 標(biāo)定核酸探針

閱讀:518          發(fā)布時(shí)間:2010-11-23
    DNA探針一般可以用32P, 35S或非放射性物質(zhì)如biotin及digoxigenin (DIG) 加以標(biāo)定;標(biāo)定時(shí)利用DNA聚合酶的活性,在DNA聚合反應(yīng)中,另加入 [α-32P] dATP,[α-32P] dCTP或DIG-11-dUTP等標(biāo)定物質(zhì),所合成出來的即是被標(biāo)定的核酸片段。目前常見的方法包括nick translation, random priming與polymerase chain reaction(PCR) 等。 若須對(duì)DNA進(jìn)行end labeling時(shí),可以進(jìn)行kinase或filling-in reaction。
 
    前者以 [γ-32P] ATP為phosphate donor,利用T4 polynucleotide kinase的活性對(duì)帶有5’-OH的DNA進(jìn)行標(biāo)定。人工合成的寡核苷酸 (oligonucleotides) 5’端為-OH group,可直接用于kinase reaction;一般DNA片段,若5’端帶有phosphate group,先經(jīng)phosphatase處理,再進(jìn)行kinase reaction。 Filling-in reaction是將DNA以特定限制酶切開,露出recessed 3’ termini后,利用Klenow的活性把3’端補(bǔ)齊 (filling-in);因此,只要加入適當(dāng)?shù)?[α-32P] dNTP,即可在DNA的3’端進(jìn)行標(biāo)定。
 
    此外,也可以應(yīng)用bacteriophage T4 DNA polymerase 的3’→5’ exonuclease 活性制造recessed 3’termini,再進(jìn)行filling-in。 至于正意股或反意股RNA探針,則可以 [α-32P] UTP或DIG-11-UTP等為標(biāo)定物質(zhì),應(yīng)用胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)加以標(biāo)定。 下面要介紹的是目前zui常用的方法:random priming及PCR。

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