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質(zhì)體快速

閱讀:234          發(fā)布時間:2010-12-3
這個方法是以phenol 及chloroform 溶菌后直接進(jìn)行電泳分析,并未將質(zhì)體DNA與宿主細(xì)菌染色體DNA 分離,得到的DNA 也不能用限制酶作用。但因其快速簡便,所以可藉的于短時間內(nèi)檢定大量轉(zhuǎn)形株中質(zhì)體DNA 的相對分子量,以初步篩選帶有重組質(zhì)體的轉(zhuǎn)形株。
 
藥品試劑:
LB/Amp plates (LB plate 添加100 μg/mL ampicillin)
1×NET (20 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 0.1 mM EDTA, pH 8.0)
PCI (25:24:1)
RNase A (1 mg/mL)
1% agarose gel
 
方法步驟:
1) 由前一天轉(zhuǎn)形所得的轉(zhuǎn)形株中,挑選12~24 個單一菌落,在LB/Amp plate上劃數(shù)道短的橫線或斜線,同時也須要接種帶有載體pQE31 的菌株,于37℃培養(yǎng)過夜或直至菌體長出。
2) 以接種環(huán)將菌體刮下,懸濁在30 μL 1×NET 中,震蕩混合均勻。
◆ 不要忘了pQE31/JM109!
3) 加入30 μL PCI,劇烈震蕩。
4) 以12,000 rpm 離心3 min (室溫)。
5) 將上層液吸至另一支干凈離心管,加1 μL RNase A 及3 μL 10×追蹤染劑,以50 V 進(jìn)行電泳分析。 由于樣品中有細(xì)菌染色體DNA,所以在加入樣品槽時需十分小心,否則DNA 極易流失在電泳緩沖液中。 電泳后,可由質(zhì)體DNA 的泳動率知其相對分子量大小?!?/div>
6) 選取帶有質(zhì)體分子量大于pQE31 的菌落,接種于3 mL LB/Amp 液體培養(yǎng)基,于37℃震蕩培養(yǎng)過夜,以抽取質(zhì)體,進(jìn)行限制酶分析。

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