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離子交換柱層析操作步驟
閱讀：4770 發(fā)布時間：2014-4-9
1.裝柱：
1.1 取出層析柱，用去離子水沖洗干凈，連接好管子后固定柱子;
1.2用水沖洗層析柱3-5次，每次10ml去離子水;
1.3取出填料，靜止至室溫后，根據(jù)需要用移液器取出3-5ml的填料進(jìn)行裝柱;
1.4用去離子水沖洗填料5個柱體積;
2.柱的平衡與上樣：
2.1用0.02M TB bufferA 緩沖液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH為7.6; 2.2對處理的樣品進(jìn)行過濾后，緩慢上樣讓蛋白充分結(jié)合;
3.洗雜蛋白：
3.1用0.02M TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱，清洗沒有結(jié)合到層析柱上的雜蛋白，至流出液與緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
3.2用含10mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱，共洗約30ml，至流出液與含10mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
3.3用含20mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱，共洗約30ml，至流出液與含20mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
3.4用含40mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱，共洗約30ml，至流出液與含40mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
3.5用含60mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱，共洗約30ml，至流出液與含60mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
3.6用含80mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱，共洗約30ml，至流出液與含80mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
3.7用含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱，共洗約30ml，至流出液與含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
(具體的洗脫梯度需根據(jù)實驗自行調(diào)整)
4.解離目的蛋白：
4.1用含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱，共洗約30ml，至流出液與含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
4.2 用含200mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱，共洗約30ml，至流出液與含200mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
4.3 用含500mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱，共洗約30ml，至流出液與含500mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
4.4用含1000mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱，共洗約30ml，至流出液與含1000mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止，流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
(具體的洗脫梯度需根據(jù)實驗自行調(diào)整)
5.柱的清洗與保存：
5.1用含1000mMNaCL的TB bufferA緩沖液(PH7.6)以沖洗層析柱，共沖洗30ml; 5.2用濃度為1.5M的NaCl溶液沖洗層析柱，共沖洗30ml; 5.3用過濾去離子水沖洗50ml;
5.4用20%乙醇沖洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。