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離子交換柱層析操作步驟

閱讀:4771        發(fā)布時(shí)間:2014-4-9
   1.裝柱:
  1.1 取出層析柱,用去離子水沖洗干凈,連接好管子后固定柱子;
  1.2用水沖洗層析柱3-5次,每次10ml去離子水;
  1.3取出填料,靜止至室溫后,根據(jù)需要用移液器取出3-5ml的填料進(jìn)行裝柱;
  1.4用去離子水沖洗填料5個(gè)柱體積;
  2.柱的平衡與上樣:
  2.1用0.02M TB bufferA 緩沖液(PH7.6)平衡Ni柱,直至流出液的pH為7.6; 2.2對(duì)處理的樣品進(jìn)行過(guò)濾后,緩慢上樣讓蛋白充分結(jié)合;
  3.洗雜蛋白:
  3.1用0.02M TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過(guò)柱,清洗沒(méi)有結(jié)合到層析柱上的雜蛋白,至流出液與緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測(cè);
  3.2用含10mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過(guò)柱,共洗約30ml,至流出液與含10mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測(cè);
  3.3用含20mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過(guò)柱,共洗約30ml,至流出液與含20mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測(cè);
  3.4用含40mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過(guò)柱,共洗約30ml,至流出液與含40mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測(cè);
  3.5用含60mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過(guò)柱,共洗約30ml,至流出液與含60mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測(cè);
  3.6用含80mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過(guò)柱,共洗約30ml,至流出液與含80mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測(cè);
  3.7用含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過(guò)柱,共洗約30ml,至流出液與含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測(cè);
  (具體的洗脫梯度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)自行調(diào)整)
  4.解離目的蛋白:
  4.1用含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過(guò)柱,共洗約30ml,至流出液與含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測(cè);
  4.2 用含200mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過(guò)柱,共洗約30ml,至流出液與含200mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測(cè);
  4.3 用含500mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過(guò)柱,共洗約30ml,至流出液與含500mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測(cè);
  4.4用含1000mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過(guò)柱,共洗約30ml,至流出液與含1000mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測(cè);
  (具體的洗脫梯度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)自行調(diào)整)
  5.柱的清洗與保存:
  5.1用含1000mMNaCL的TB bufferA緩沖液(PH7.6)以沖洗層析柱,共沖洗30ml; 5.2用濃度為1.5M的NaCl溶液沖洗層析柱,共沖洗30ml; 5.3用過(guò)濾去離子水沖洗50ml;
  5.4用20%乙醇沖洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。

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