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上海一基實(shí)業(yè)有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第16年

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酶法試劑盒操作步驟

時(shí)間:2024/5/31閱讀:625
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一、實(shí)驗(yàn)原理
酶法試劑盒(ELISA)實(shí)驗(yàn)原理是使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性;使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。

二、操作步驟
1.ELISA在操作前試劑和組分都先恢復(fù)到室溫,標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品,建議做復(fù)孔。按前面試劑準(zhǔn)備中描述的方法,配制好試劑盒各種組分的工作液。從鋁箔袋中取出所需板條,剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。


2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,樣本孔加待測(cè)樣本50μL,空白孔不加。除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL。用封板膜蓋住反應(yīng)板,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。


3.溫育好后揭開(kāi)封板膜,棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置20s,甩去洗滌液,吸水紙上拍干。如此重復(fù)4次(共洗板5次)。若使用自動(dòng)洗板機(jī),請(qǐng)按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板,添加浸泡20s的程序,可以提高檢測(cè)的精度。洗板結(jié)束,加底物前,要在干凈不掉屑的紙上,充分拍干反應(yīng)板。洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟,但卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。

ELSIA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,而在洗滌時(shí)應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。可以說(shuō)在ELISA 操作中,洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù),應(yīng)引起操作者的高度重視,操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌,不得馬虎。
   
4.洗板好后將底物A和B按1:1體積充分混合,所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應(yīng)板,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。所有孔加入終止液50μL,在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度(OD值)。
   
5.檢測(cè)完成后,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的吸光度(OD值)作為橫坐標(biāo),利用計(jì)算機(jī)軟件,采用四參數(shù)Logistic曲線擬合(4-pl),創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,通過(guò)樣本的吸光度(OD值),利用方程計(jì)算樣品的濃度值。如果樣品被稀釋,通過(guò)上述方法測(cè)的的濃度值,要乘以稀釋倍數(shù),才是樣品的終濃度。


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