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3D全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)助力解鎖關(guān)鍵數(shù)據(jù)

時間:2025-1-25閱讀:287

嵌合抗原受體T細胞(CAR T)免疫療法是治療惡性腫瘤的新興手段,抗CD19嵌合抗原受體T細胞(CD19.CAR T)在B細胞惡性腫瘤治療療效顯著,但常伴有免疫效應(yīng)細胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征(ICANS)這一不良反應(yīng),其臨床特征包括腦病、認知障礙、語言障礙、癲癇發(fā)作以及較少見的腦水腫。雖然ICANS致死率低(1%–2%),但其治療需要使用大劑量類固醇和免疫抑制療法,會影響CAR T細胞活性和治療效果,并增加非復(fù)發(fā)性死亡率。近期,博洛尼亞大學(xué)發(fā)表題為 “CAR+ extracellular vesicles predict ICANS in patients with B cell lymphomas   treated with CD19-directed CAR T cells"為題的文章,借助3D全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)揭示了CAR+細胞外囊泡(CAR+EVs)在預(yù)測和理解這種神經(jīng)毒性反應(yīng)中的重要作用,為研究者預(yù)防和管理CAR T細胞治療的神經(jīng)毒性反應(yīng)提供了新的思路,對推動 CAR T 細胞免疫療法安全應(yīng)用與持續(xù)發(fā)展意義重大。


文中使用的3D全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)是法國Abbelight公司設(shè)計研發(fā)的,是一款無需純化、可全自動表征分析單個外泌體的創(chuàng)新設(shè)備。它能夠提供外泌體粒徑、亞型分布、攜帶蛋白表達及單個外泌體的膜蛋白與生物標(biāo)志物共定位等信息,操作簡單,結(jié)果可靠。設(shè)備單分子定位成像技術(shù),可獲得精度高達20 nm的單個外泌體的超分辨成像結(jié)果,為該研究提供了關(guān)鍵的技術(shù)支持。


3D全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)

 

研究者針對100名B細胞淋巴瘤患者開展實驗,為其注射CD19.CAR T細胞,在30天內(nèi)一共有29人引發(fā)了ICANS?;颊叩难獦咏Y(jié)果表明,患有ICANS的患者與未患ICANS的患者的CAR T細胞擴增峰值與30天內(nèi)的曲線下面積(AUC)無顯著差異,但到達峰值的時間(TTP)更短(圖1),同時CAR_DNA水平到達峰值的時間也更短(圖2),這種動力學(xué)上的差異代表著CD19.CAR T細胞更快地到達病灶并激活。



圖1



圖2

 

先前已有研究指出,CAR   T細胞具備分泌攜帶有CAR的外泌體(EV)的能力。研究者進一步提出假設(shè),認為CAR T血漿外泌體的檢測可以提供CAR T細胞的遷移和功能的信息。首先在含/不含CD19+靶細胞的環(huán)境下分別培養(yǎng)了19BBζ.CAR T和19BBζ.eGFP.CAR T細胞。24小時后,收集培養(yǎng)上清并使用包被了CD63,CD81和CD9抗體的玻片捕獲了外泌體,之后使用3D全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)進行超分辨成像可以確認在CD19+靶細胞共培養(yǎng)的19BBζ.eGFP.CAR   T細胞上清中含有CAR+EV(圖3A);單外泌體STORM成像同樣確認在CD19+共培養(yǎng)的19BBζ.CAR T細胞上清中也含有CAR+EV(圖3B&C);將共聚焦與STORM成像的數(shù)據(jù)結(jié)合,能夠確認19BBζ.CAR T的細胞質(zhì)中含有大量CAR+EV(圖3D&E)。STORM成像結(jié)果的共定位分析可以看出,19BBζ.CAR T和19BBζ.eGFP.CAR T細胞中的大多數(shù)外泌體的CD19.CAR蛋白與CD63以單個分子的水平顯示位于同一外泌體上,即兩者共定位(圖3F&G)。以上結(jié)果表明,在CD19+靶細胞誘導(dǎo)下,CD19.CAR蛋白以與CD63共定位的CAR+EV的形式大量釋放到了細胞上清中。



圖3 19BBζ.CAR   T與19BBζ.eGFP.CAR T細胞的STORM/共聚焦成像分析

 

基于細胞實驗結(jié)果,研究者對接受了CAR.T治療的患者的血漿進行了流式(圖4左)和STORM檢測(圖4右),在血漿中發(fā)現(xiàn)了帶有外泌體和T細胞標(biāo)記物的CAR+EV。進一步統(tǒng)計分析顯示,后續(xù)發(fā)病的ICANS患者的day+1的CAR+EV數(shù)量(圖5A),CAR+EV的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)(圖5B)及AUC(圖5C),CAR+EV濃度的峰值(圖5E),hour+1和day+1的水平(圖5F)均顯著增高;ROC分析顯示,hour+1時132.8   CAR+EV/μL以上的濃度的預(yù)測ICANS發(fā)生具有89.29%的靈敏度和74.58%的特異性,day+1時224.5 CAR+EV/μL以上的濃度的預(yù)測靈敏度和準(zhǔn)確性可達96.55%和 80.36%(圖5G)。



圖4 血漿內(nèi)CAR+EV的流式和單外泌體成像



圖5 血漿CAR+EV:早期ICANS標(biāo)記物

 

在本研究中可以發(fā)現(xiàn),CAR+EV的釋放是CD19.CAR T細胞在體外激活的信號,因為CAR+EV主要在識別靶細胞后釋放。3D全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)的STORM成像結(jié)果表明,多數(shù)CAR+EV上含有標(biāo)記蛋白CD63,來源于CD19.CAR T細胞的細胞質(zhì)中預(yù)組裝成的富含CD63的顆粒。STORM成像也證實了接受CAR T治療的病人血漿中含有外泌體標(biāo)記物和CAR蛋白的CAR+EV;由于CD19.CAR   T細胞的激活在ICANS患者中顯著上升,血漿CAR+EV水平可以作為可信的早期ICANS指標(biāo)。



參考文獻:


[1]. Storci,   G., De Felice, F., Ricci, F., Santi, S., Messelodi, D., Bertuccio, S. N., ... & Bonifazi, F. (2024). CAR+ extracellular vesicles predict ICANS in patients with B cell lymphomas treated with CD19-directed CAR T cells. The Journal of Clinical Investigation, 134(14).


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