嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR T）免疫療法是治療惡性腫瘤的新興手段，抗CD19嵌合抗原受體T細(xì)胞（CD19.CAR T）在B細(xì)胞惡性腫瘤治療療效顯著，但常伴有免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（ICANS）這一不良反應(yīng)，其臨床特征包括腦病、認(rèn)知障礙、語(yǔ)言障礙、癲癇發(fā)作以及較少見(jiàn)的腦水腫。雖然ICANS致死率低（1%–2%），但其治療需要使用大劑量類固醇和免疫抑制療法，會(huì)影響CAR T細(xì)胞活性和治療效果，并增加非復(fù)發(fā)性死亡率。近期，博洛尼亞大學(xué)發(fā)表題為 “CAR+ extracellular vesicles predict ICANS in patients with B cell lymphomas   treated with CD19-directed CAR T cells"為題的文章，借助3D全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)揭示了CAR+細(xì)胞外囊泡（CAR+EVs）在預(yù)測(cè)和理解這種神經(jīng)毒性反應(yīng)中的重要作用，為研究者預(yù)防和管理CAR T細(xì)胞治療的神經(jīng)毒性反應(yīng)提供了新的思路，對(duì)推動(dòng) CAR T 細(xì)胞免疫療法安全應(yīng)用與持續(xù)發(fā)展意義重大。

文中使用的3D全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)是法國(guó)Abbelight公司設(shè)計(jì)研發(fā)的，是一款無(wú)需純化、可全自動(dòng)表征分析單個(gè)外泌體的創(chuàng)新設(shè)備。它能夠提供外泌體粒徑、亞型分布、攜帶蛋白表達(dá)及單個(gè)外泌體的膜蛋白與生物標(biāo)志物共定位等信息，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠。設(shè)備單分子定位成像技術(shù)，可獲得精度高達(dá)20 nm的單個(gè)外泌體的超分辨成像結(jié)果，為該研究提供了關(guān)鍵的技術(shù)支持。

3D全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)

研究者針對(duì)100名B細(xì)胞淋巴瘤患者開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，為其注射CD19.CAR T細(xì)胞，在30天內(nèi)一共有29人引發(fā)了ICANS。患者的血樣結(jié)果表明，患有ICANS的患者與未患ICANS的患者的CAR T細(xì)胞擴(kuò)增峰值與30天內(nèi)的曲線下面積（AUC）無(wú)顯著差異，但到達(dá)峰值的時(shí)間（TTP）更短（圖1），同時(shí)CAR_DNA水平到達(dá)峰值的時(shí)間也更短（圖2），這種動(dòng)力學(xué)上的差異代表著CD19.CAR T細(xì)胞更快地到達(dá)病灶并激活。

圖1

圖2

先前已有研究指出，CAR   T細(xì)胞具備分泌攜帶有CAR的外泌體（EV）的能力。研究者進(jìn)一步提出假設(shè)，認(rèn)為CAR T血漿外泌體的檢測(cè)可以提供CAR T細(xì)胞的遷移和功能的信息。首先在含/不含CD19+靶細(xì)胞的環(huán)境下分別培養(yǎng)了19BBζ.CAR T和19BBζ.eGFP.CAR T細(xì)胞。24小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清并使用包被了CD63，CD81和CD9抗體的玻片捕獲了外泌體，之后使用3D全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)進(jìn)行超分辨成像可以確認(rèn)在CD19+靶細(xì)胞共培養(yǎng)的19BBζ.eGFP.CAR   T細(xì)胞上清中含有CAR+EV（圖3A）；單外泌體STORM成像同樣確認(rèn)在CD19+共培養(yǎng)的19BBζ.CAR T細(xì)胞上清中也含有CAR+EV（圖3B&C）；將共聚焦與STORM成像的數(shù)據(jù)結(jié)合，能夠確認(rèn)19BBζ.CAR T的細(xì)胞質(zhì)中含有大量CAR+EV（圖3D&E）。STORM成像結(jié)果的共定位分析可以看出，19BBζ.CAR T和19BBζ.eGFP.CAR T細(xì)胞中的大多數(shù)外泌體的CD19.CAR蛋白與CD63以單個(gè)分子的水平顯示位于同一外泌體上，即兩者共定位（圖3F&G）。以上結(jié)果表明，在CD19+靶細(xì)胞誘導(dǎo)下，CD19.CAR蛋白以與CD63共定位的CAR+EV的形式大量釋放到了細(xì)胞上清中。

圖3 19BBζ.CAR   T與19BBζ.eGFP.CAR T細(xì)胞的STORM/共聚焦成像分析

基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究者對(duì)接受了CAR.T治療的患者的血漿進(jìn)行了流式（圖4左）和STORM檢測(cè)（圖4右），在血漿中發(fā)現(xiàn)了帶有外泌體和T細(xì)胞標(biāo)記物的CAR+EV。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示，后續(xù)發(fā)病的ICANS患者的day+1的CAR+EV數(shù)量（圖5A），CAR+EV的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)（圖5B）及AUC（圖5C），CAR+EV濃度的峰值（圖5E），hour+1和day+1的水平（圖5F）均顯著增高；ROC分析顯示，hour+1時(shí)132.8   CAR+EV/μL以上的濃度的預(yù)測(cè)ICANS發(fā)生具有89.29%的靈敏度和74.58%的特異性，day+1時(shí)224.5 CAR+EV/μL以上的濃度的預(yù)測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性可達(dá)96.55%和 80.36%（圖5G）。

圖4 血漿內(nèi)CAR+EV的流式和單外泌體成像

圖5 血漿CAR+EV：早期ICANS標(biāo)記物

在本研究中可以發(fā)現(xiàn)，CAR+EV的釋放是CD19.CAR T細(xì)胞在體外激活的信號(hào)，因?yàn)镃AR+EV主要在識(shí)別靶細(xì)胞后釋放。3D全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)的STORM成像結(jié)果表明，多數(shù)CAR+EV上含有標(biāo)記蛋白CD63，來(lái)源于CD19.CAR T細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中預(yù)組裝成的富含CD63的顆粒。STORM成像也證實(shí)了接受CAR T治療的病人血漿中含有外泌體標(biāo)記物和CAR蛋白的CAR+EV；由于CD19.CAR   T細(xì)胞的激活在ICANS患者中顯著上升，血漿CAR+EV水平可以作為可信的早期ICANS指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：

[1]. Storci,   G., De Felice, F., Ricci, F., Santi, S., Messelodi, D., Bertuccio, S. N., ... & Bonifazi, F. (2024). CAR+ extracellular vesicles predict ICANS in patients with B cell lymphomas treated with CD19-directed CAR T cells. The Journal of Clinical Investigation, 134(14).