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分光光度計如何測定核酸蛋白

時間:2015/12/15閱讀:1614
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分光光度計測定核酸蛋白方法:

分光光度計蛋白質(zhì)測定過程其實非常簡單,先測試空白液,然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),一般要消除320 nm的“背景”信息,設(shè)定此功能“開”。與測試核酸類似,要求A 280的吸光值至少大于0.1A,較為佳的線性范圍在1.0-1.5之間。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時,發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上,只要觀察A 280的吸光值的變化范圍不*過1%,表明結(jié)果非常穩(wěn)定。

漂移的原因是因為Warburg公式吸光值換算成濃度,乘以一定的系數(shù),只要吸光值有少許改變,濃度就會被放大,從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。

 

核酸的定量是分光光度計使用頻率較為高的功能??梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的較為高吸收峰的吸收波長260 nm。 每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如:1OD的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測試空白液和樣品液。然而,實驗并非一帆風順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者較為頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。

分光光度計 

事實上,分光光度計的設(shè)計原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,即儀器有一定的準確度和度。還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測試時,離子濃度太高,也會導致讀數(shù)漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,如TE,可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了較為大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值在0.1-1.。在此范圍內(nèi),顆粒的干擾相對較小,結(jié)果穩(wěn)定。

 

從而意味著樣品的濃度不能過低,或者過高(*過光度計的測試范圍)。較為后是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現(xiàn)負值;混合液不能存在氣泡,空白液無懸浮物,否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的較為小體積等多個操作事項。

 

除了核酸濃度,分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,如 A 260 / A 280的比值,用于評估樣品的純度,因為蛋白的吸收峰是 280 nm。純凈的樣品,比值大于 1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于 1.8 或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A 230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,A 320 一般是 0。

 

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