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北京科譽興業(yè)科技發(fā)展有限公司

熒光定量PCR儀原理

時間:2016-5-18 閱讀:4931
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實時熒光定量PCR技術(shù)[1]  ,是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。

檢測方法

1.SYBRGreenⅠ法:

在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。

SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖

PCR產(chǎn)物熔解曲線圖(單一峰圖表明PCR擴增產(chǎn)物的單一性)

2.TaqMan探針法:

探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成*同步。

實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴增反應(yīng)中,以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。·

Real-timePCR是在PCR擴增過程中,通過熒光信號,對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期,模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系,所以成為定量的依據(jù)。

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