DNA印跡法(Southern blot, SB)

SB已廣泛應(yīng)用于分析DNA和端粒結(jié)構(gòu). 用限制性核酸內(nèi)切酶Hin fⅠ或Rsa Ⅰ消化DNA, 然后瓊脂糖電泳分離不同大小的片段, 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維或尼龍膜上. 用32P同位素或生物素、堿性磷酸酯酶標記的端粒特異探針與其雜交(CCCATT)n. 末端限制酶切片段(TRF)通過光密度計定量測量. 選用Hin fⅠ或Rsa Ⅰ是因為這兩種酶能頻繁的切斷DNA, 使亞端粒區(qū)域變得盡可能小. 用于SB分析的DNA應(yīng)該是沒有被打碎和純度較高的, 但是因為DNA的高分子量、高黏度使得這點較難保證. TRF法得到的數(shù)據(jù)除代表所有染色體端粒的長度外, 還包括部分亞端粒區(qū)長度. 因此TRF法不能提供端粒的實際長度.

雜交保護分析法(hybridization protection assay,HPA)

HPA需要制備基因組DNA、細胞或組織溶胞產(chǎn)物同吖啶酯(AE)標記端粒的探針進行雜交, 檢測發(fā)光強度, 確定端粒在Alu序列中比例. 研究表明, Alu序列中比例為0.01的端粒大約與2 kb的TRF法測量的端粒長度對應(yīng). HPA不需要完整的或沒有修剪的DNA, 但是, 推薦使用下限為10 ng修剪過的DNA. 純化的細胞DNA或至少含有1000個細胞的組織溶胞產(chǎn)物都能用于測量. 雖然HPA不包括亞端粒序列, 但是HPA法沒有給出詳細的細胞或染色體水平的端粒信息,也不能直接測定端粒長度.

熒光原位雜交(FISH)

FISH直接將寡核苷酸探針標記在端粒序列上. 標準的FISH包括制作分裂中期的染色體以及DNA變性, 與異硫氰酸熒光素(FITC)或Cy3標記的寡核苷酸探針雜交, 用DAPI或PI復(fù)染, zui后用熒光顯微鏡檢測信號. FISH方法被廣泛地應(yīng)用于特定基因的細胞遺傳學(xué)研究. FISH自身的特點使其適合于測定端粒長度, 如小的端粒探針可增加進入細胞的滲入度, 而且單鏈探針不需要退火.幾種改良的FISH: 用FISH方法進行的端粒定量被稱作Q-FISH[14-15](Quantitative-FISH). Lansdorpet al用核酸肽(PNA)寡核苷酸探針(PNAFISH)代替寡核苷酸探針改良了Q-FISH法. 因為帶電的脫氧核糖酸鹽主鏈被肽鏈連接的不帶電N-(2-氨基乙基)-甘氨酸主鏈替代, PNA探針的復(fù)式結(jié)構(gòu)遠比DNA/DNA或DNA/RNA的穩(wěn)定.結(jié)合FISH和免疫染色(I-FISH)的方法可以測量用甲醛固定,石蠟包埋的人組織樣本的端粒,同時還可以鑒別細胞種類. 在I-FISH中只需用很少的細胞, 這種方法可以忽略不同細胞種類而直接比較正常和癌變細胞的端粒長度. Perneret al發(fā)明了端粒/著絲粒-FISH(T/C-FISH)測量每個單獨的染色體臂的端粒長度的方法, 2號染色體著絲粒作內(nèi)參. 熒光強度的比率經(jīng)過計算同TRF法有很好的相關(guān)性. Yan et al 在染色質(zhì)/DNA纖維制備中應(yīng)用了Fiber-FISH法. 端粒的特異PNA Green探針和1q亞端粒的特異Red探針在染色質(zhì)纖維上同時雜交, 已知的1q亞端粒探針大小為100 kb. 因為解壓縮的染色質(zhì)的可變伸縮性使得纖維雜交的時候顯色長度變得可變. 然而, 目的序列同亞端粒探針有相似的伸縮程度. 因此, 用已知大小的亞端粒探針作對照對判斷DNA纖維解壓縮的程度起很重要的作用. 在檢測淋巴母細胞系1q時, 端粒和亞端粒排列在纖維上的信號范圍分別在0.9 μm-2.9 μm和13.8-29 μm之間. 這意味著根據(jù)纖維的不同伸展程度雜交到纖維上的探針可見長度為3.4-7.2kb/μm(平均5.5 kb/μm) .

流式細胞計量-熒光原位雜交(Flow-FISH)

Flow-FISH包括6個基本步驟: 細胞分離, DNA變性并與PNA探針雜交, 洗去多余探針, 復(fù)染后用流式細胞計量術(shù)采集和分析.來自不同細胞系和臨床樣本的骨髓、血液淋巴結(jié)、經(jīng)過檢測的扁桃體的端粒長度值同TRF法有很好的相關(guān)性. 同Q-FISH相反, Flow-FISH可以分析周期中和非周期中的細胞端粒, 整個操作只需1d. 此外, 不同的細胞亞群能夠同時處理, 這對于分析較難純化的細胞是很有用的. Flow-FISH法測定端粒長度在研究有核血細胞在正常個體和病態(tài)個體的血液病時有很高的實用性.Flow-FISH同時分析端粒長度和細胞表型的技術(shù)難度很高, 因為只有很少的帶有合適發(fā)射光譜的熒光染料能承受DNA變性和PNA雜交的條件. Baerlocher et al運用Hydra 96孔微型分注器測量端粒長度, 他可以定量差異很小(0.5kb)的端粒片段, 而且只用很少的細胞(1000個).當同時測量復(fù)雜樣品時, 這種自動化操作盡顯優(yōu)勢.

寡核苷酸引物原位DNA合成法(PRINS)

寡核苷酸引物(CCCTAA)7與分裂中期或分裂間期的同源染色體退火、雜交, 加入熱穩(wěn)定DNA聚合酶和熒光標記的核苷酸后引物開始延伸,zui終通過熒光顯微鏡分析熒光信號.許多位點的引物同時擴增保證了充足的熒光信號得以檢測,但是不均勻的引物退火可能導(dǎo)致端粒長度測量不充分. 一些用于增加標記和退火功效的改良, 雙脫氧核苷酸的參與可以通過減少染色體被隨機打斷的非相關(guān)DNA的擴增而使更多特異端粒序列被標記. zui近, Yan et al用雙鏈PRINS法, 即(TTAGGG)7和(CCCTAA)7兩個引物標記端粒DNA的正鏈和反鏈.兩個方向的標記使產(chǎn)物的信號得以加強, 標記功效增加到78%至95%.

定量PCR

以前認為用寡核苷酸引物TTAGGG和CCCTAA進行的PCR反應(yīng)不可能用于測量端粒, 因為引物自身之間可能發(fā)生雜交.但是如果引物被加以修飾, 6個重復(fù)堿基中包括兩個錯配堿基和4個連續(xù)配對堿基, 這樣兩個引物便不會互相雜交. 在Q-PCR中端粒(T)重復(fù)拷貝的比例同單個拷貝的基因(S)的比例是確定的. T/S的比例同端粒平均長度成正比關(guān)系,端粒長度可根據(jù)T/S率測定.

單個端粒長度分析(SA)

SA是在單個染色體水平上基于PCR的端粒測量方法.

第1步是“orette”(在與端粒G懸突不配對的20個核苷酸后有7個同源的TTAGGG接頭)的退火.第2步是將“orette”連接到富C鏈5末端.此后用識別orette尾巴的tail引物同亞端粒上游引物進行PCR擴增.在研究這個區(qū)域的多態(tài)現(xiàn)象時, 上游引物可以是特異的等位基因. SAzui先被用于分析人類X染色體短臂. zui近對秀麗隱桿線蟲的端粒和沃納綜合征的成纖維細胞的端粒的研究表明, 在單個染色體水平上SA的分析有很高的可靠性.SA的PCR擴增具有高度的端粒特異性, 用SA測量人類成纖維細胞的XpYp端粒長度始終比TRF的平均值小, 且這兩者成線性關(guān)系, 說明SA沒有包括亞端粒長度.