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技術(shù)文章

質(zhì)粒DNA提取實驗的方法原理以及實驗步驟

閱讀:6137          發(fā)布時間:2012-12-26

實驗方法原理
質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子,是獨立于細菌染色體之外進行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進行分子生物學(xué)實驗操作,進行遺傳工程改良物種等工作時zui主要的DNA載體。
 
提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步:
①細菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴增
②細菌菌體的裂解
③質(zhì)粒DNA的純化
實驗方法原理
質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子,是獨立于細菌染色體之外進行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進行分子生物學(xué)實驗操作,進行遺傳工程改良物種等工作時zui主要的DNA載體。
 
提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步:
①細菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴增
②細菌菌體的裂解
③質(zhì)粒DNA的純化
實驗方法原理
質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子,是獨立于細菌染色體之外進行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進行分子生物學(xué)實驗操作,進行遺傳工程改良物種等工作時zui主要的DNA載體。
 
提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步:
①細菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴增
②細菌菌體的裂解
③質(zhì)粒DNA的純化
質(zhì)粒多為一些雙鏈、環(huán)狀的DNA分子,是獨立于細菌染色體之外進行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。質(zhì)粒是進行分子生物學(xué)實驗操作,進行遺傳工程改良物種等工作時zui主要的DNA載體。
 提取質(zhì)粒的基本步驟分為三步:

①細菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴增

②細菌菌體的裂解

③質(zhì)粒DNA的純化
 

一、材料與試劑準(zhǔn)備
 
1.  材料:大腸桿菌。
 
2.  儀器:超凈工作臺,培養(yǎng)箱,搖床,恒溫水浴鍋,臺式離心機,取液器一套,低溫冰箱,冷凍真空干燥機,電泳儀,水平電泳槽,紫外觀測儀。
 
3.  試劑:
 
(1)Solution I :25 mM Tris-Hcl(pH7.4),10 mM EDTA(pH8.0),50 mM葡萄糖,高壓滅菌,4℃保存。
(2)Solution II :0.2 M NaOH, 1%SDS 現(xiàn)配現(xiàn)用。
(3)Solution III :5 N KAc pH4.8,高壓滅菌,4℃保存。
(4)3 M NaAc PH5.2,高壓滅菌,4℃保存。
(5)異丙醇,溶菌酶(8 mg/ml),酚/氯仿,無水乙醇,70%乙醇,LB培養(yǎng)基,電泳試劑。
 
二、操作步驟
 
1.  細菌繁殖:LB培養(yǎng)基,2 ml/20ml,37℃,200 rpm,搖一搖,過夜。
 
2.  離心10 min,5 000 rpm, 4℃;棄上淸液。
 
3.  沉淀(菌體細胞)預(yù)冷的TES緩沖液洗滌,離心10 min,5 000 rpm, 4℃,加入預(yù)冷的1 ml Solution I,冰浴10 min。
 
4.  重新懸浮,加入150 ul溶菌酶母液,室溫放置5 min。
 
5.  加入1.2 ml Solution II, 冰浴5 min。
 
6.  加入0.9 ml預(yù)冷乙酸鉀,混勻,離心10 min,12 000 rpm,4℃。
 
7.  加入1.5 ml異丙醇,-20℃冰箱內(nèi)放置15 min。
 
8.  離心10 min,12 000 rpm,4℃。
 
9.  取沉淀,懸于400 ul TE緩沖液中。
 
10.  加入40 ul,3 M NaAc。
 
11.  酚/氯仿,抽提,乙醇沉淀。
 
12.  離心10 min,12 000 rpm,4℃。
 
13.  取沉淀,冷凍干燥,再懸浮于50 ul TE緩沖液中。
 
14.  電泳檢測提取DNA的質(zhì)量。

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