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恒遠(yuǎn)告訴大家：WB實(shí)驗(yàn)的常見問題答疑（2）
閱讀：1723 發(fā)布時(shí)間：2012-8-7上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司是一家生物技術(shù)企業(yè)，主要從事免疫學(xué)、分子生物學(xué)和常規(guī)生化試劑的研發(fā)、銷售。并代理銷售Omega、Sigma、R&D、ATCC、HYCLONE等二十多家國外，致力于為廣大高校、科研院所和企事業(yè)單位提供*的科研試劑和完善的技術(shù)服務(wù)，滿足生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生物科技實(shí)驗(yàn)需求。
11、抗原檢測出的分子量比資料上的大，是怎么回事？
答：a）抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時(shí)間延長，可以打開二聚體。b）蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等
12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么？
答：可能是：a）樣品濃度過低；b）轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠，。
答：可能是：a）樣品濃度過低；b）轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠，。
13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等？
答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。
14、要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎？做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎？
答：①免疫組化可以用來進(jìn)行定位，但是不能定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量，但是不能定位。
②兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會(huì)說明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
15、做Western Blot時(shí)，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？
答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反復(fù)凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建議檢查Western Blot過程，提高一抗?jié)舛?。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，能多加幾中種蛋白酶抑制劑。
16、細(xì)胞水平要做western blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot？
答：一般5×10^6就足夠了
17、同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？
答：能，沒有問題。
18、同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測嗎？
答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測幾十種樣品。
19、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時(shí)加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？
答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長時(shí)間，加20％甲醇
答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。
14、要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎？做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎？
答：①免疫組化可以用來進(jìn)行定位，但是不能定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量，但是不能定位。
②兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會(huì)說明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
15、做Western Blot時(shí)，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？
答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反復(fù)凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建議檢查Western Blot過程，提高一抗?jié)舛?。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，能多加幾中種蛋白酶抑制劑。
16、細(xì)胞水平要做western blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot？
答：一般5×10^6就足夠了
17、同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？
答：能，沒有問題。
18、同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測嗎？
答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測幾十種樣品。
19、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時(shí)加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？
答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長時(shí)間，加20％甲醇
上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司提供試劑盒代測以及實(shí)驗(yàn)室外包服務(wù)，如果你想了解更多關(guān)于western blot實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)信息，來函！