1.冷凍保存方法:

(1)傳統(tǒng)方法:冷存管置于4C10分鐘-->-20C30分鐘-->-80C 16~ 18小時(shí)(或隔夜)-->液氮槽vaporphase長期儲(chǔ)存。

-20C不可超過1小時(shí)，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

(2)程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1~-3C/分鐘之速度由室溫降至(-80C以下) -120C，再放在液氮槽vaporphase長期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。

(3)HAKATA無血清細(xì)胞凍存： 加入HAKATA無血清細(xì)胞凍存液制成懸液，直接凍于-80°C，可保存≥5年。

2.操作步驟:

(1)冷凍前24-48小時(shí)更換半里或全里培養(yǎng)基，使細(xì)胞處于指數(shù)生長期。

(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):另取一離心管，加入培養(yǎng)基、血清，逐滴加入二甲基亞礬(DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。

(3)離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞，取少里細(xì)胞懸浮液(約0.1m1)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。

(4)取與細(xì)胞懸液等里的凍存液，緩慢逐商加入細(xì)胞懸液，并晃動(dòng)試管，制成細(xì)胞凍存懸液( DMSO后濃度為5~ 10%)，使細(xì)胞濃度為1~5x 10*cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1~ 2nl/mal,并取.少里細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。嚴(yán)密封口后，注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期。然后進(jìn)行凍存。