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3H-TdR摻入法檢測IL-2的生物活性

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上海一基實業(yè)有限公司
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【材料和試劑】

（1）反應(yīng)細(xì)胞：CTLL-2，存活率應(yīng)＞95%。

（2） IL-2標(biāo)準(zhǔn)品：倍比稀釋為不同濃度。

（3）待測樣品：倍比稀釋為不同濃度。

（4） 10% Fcs-RPMI-1640*培養(yǎng)液

（5） ³H-TdR

（6） 96孔培養(yǎng)板，刻度吸管，毛細(xì)吸管，刻度離心管，離心機，加樣器（頭），細(xì)胞計數(shù)板，倒置顯微鏡，超凈工作臺，CO₂培養(yǎng)箱，微量細(xì)胞收集儀，玻璃纖維濾紙，ß液閃計數(shù)儀。

【操作步驟】

（1）用10 %FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌CTLL-2細(xì)胞2次，1000r/min離心5min，以去除原生長培養(yǎng)液（含IL-2）；

（2）用10% Fcs-RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1×10⁵/ml；

（3）將不同倍比稀釋度的IL-2的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μL/孔，各設(shè)3復(fù)孔，同時設(shè)培養(yǎng)液對照；

（4）各孔均加入CTLL-2細(xì)胞懸液，100μl/孔；

（5）置37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；

（6）每孔均加入³H-TdR，0.5μci/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h；

（7）用微量細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞于玻璃纖維紙上，用ß液閃計數(shù)儀測定各孔cpm值。測定CPM值的*時間應(yīng)是培養(yǎng)液對照（無IL-2）細(xì)胞全部或大部分死亡而加有IL-2孔細(xì)胞生長旺盛時。

【結(jié)果分析】

（1）每孔cpm值為了復(fù)孔的平均值，再減去培養(yǎng)液對照，即為各孔zui終c

（2）計算IL-2活性單位（參見IL-1、IL-2的MTT比色檢測法）可按下式計算：

樣品IL-2活性單位（U/ml）	=	達(dá)50%zui大增殖³H-TdR滲入值的樣品稀釋度	×	標(biāo)準(zhǔn)品IL-2活性單位（U/ml）
		達(dá)50%zui大增殖³H-TdR滲入值的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度

【注意事項】

（1）用¹²⁵I-UdR代替3H-TdR進行IL-2活性檢測。其優(yōu)點是不需ß液體閃爍測定所需的試劑和設(shè)備，只需一臺小型γ計數(shù)儀即可，并可節(jié)省時間和減少ß液體閃爍操作中出現(xiàn)的誤差。其缺點是¹²⁵I-UdR半衰期較短，需要定期供應(yīng)?；痉椒ㄍ?sup>3H-TdR摻入法，只是用¹²⁵I-UdR代替³H-TdR，0.2μci/孔，然后再加入1mmol/L的5-氟尿嘧啶5μl，繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞用γ計數(shù)儀測定cpm值。

（2）其余注意事項可參見MTT法檢測IL-2活性部分。

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3H-TdR摻入法檢測IL-2的生物活性

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