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PCR擴(kuò)增反應(yīng)的步驟和影響因素分析

閱讀:5765        發(fā)布時(shí)間:2020-7-13
PCR(Polymerase Chain Reaction),是指在DNA聚合酶催化下,以母鏈DNA為模板,以特定引物為延伸起點(diǎn)。通過(guò)變性、退火、延伸等步驟,體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。

經(jīng)典的PCR擴(kuò)增反應(yīng)分為三步:

1、高溫變性:模板DNA經(jīng)加熱至95℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;

2、低溫退火:模板DNA與引物的復(fù)性,模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;

3、適溫延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶的作用下,以核苷酸為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
 

影響擴(kuò)增的因素:

1、由于各種原因,造成的PCR擴(kuò)增體系中出現(xiàn)了非目的檢測(cè)樣本本身的模板,使得PCR結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性

2、操作錯(cuò)誤或者誤差造成的模板間交叉污染

3、PCR試劑的污染

4、PCR實(shí)驗(yàn)器材的污染

5、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠污染


防止污染的首要原則是要設(shè)置NTC(No Template Contro|)對(duì)照,一個(gè)不含有模板DNA但含有PCR體系中所有其他成分的對(duì)照。如果不能在污染的第一時(shí)間發(fā)現(xiàn),會(huì)導(dǎo)致后續(xù)一系列的數(shù)據(jù)無(wú)法使用。準(zhǔn)備PCR體系的移液器要,千萬(wàn)不能用吸取過(guò)PCR產(chǎn)物的移液器去準(zhǔn)備PCR體系。
 
 

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