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大鼠嗜酸粒細胞趨化因子試劑盒   大鼠ECF  大鼠elisa試劑盒

產(chǎn)品名稱：大鼠嗜酸粒細胞趨化因子試劑盒         

各種種屬：人、大小鼠、豚鼠、兔子、豬、犬、牛、羊…
標(biāo)本齊全：血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿、組織液、關(guān)節(jié)液、胸腔溢液等…
檢測方法：酶聯(lián)免疫法/酶免法（ELISA）

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗小鼠Ferritin單抗包被于酶標(biāo)板上，實驗時標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的Ferritin會與單抗結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗小鼠Ferritin抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素?？剐∈驠erritin抗體與結(jié)合在單抗上的小鼠Ferritin結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，TMB在辣根過氧化物酶的催化下現(xiàn)藍色，加終止液后變黃。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測OD值，F(xiàn)erritin濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中Ferritin的濃度。

標(biāo)本收集:

1.       血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。

2.       血漿：抗凝劑推薦使用EDTA，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂標(biāo)本。

3.       其它生物標(biāo)本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測

4.       標(biāo)本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

5.       標(biāo)本收集后若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃/-80℃電冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融，1-6月內(nèi)檢測,4℃保存的應(yīng)在1周內(nèi)進行檢測。

6.  如果您的樣本中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品zui高值，請根據(jù)實際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議先做預(yù)實驗，以確定稀釋倍數(shù)）。

試驗所需自備物品:

1.  酶標(biāo)儀（450nm波長濾光片）

2.  高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μl, 2-20μl, 20-200μl, 200-1000μl

3.  37℃恒溫箱, 雙蒸水或去離子水

4.  吸水紙

檢測前準(zhǔn)備工作:

1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋（1:25）。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正常現(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶*溶解后再配制洗滌液。（加熱溫度不要超過50℃）使用時洗滌液應(yīng)為室溫。

3.  標(biāo)準(zhǔn)品: 加入標(biāo)準(zhǔn)品&標(biāo)本稀釋液1.0ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置10分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻（濃度為5000 pg/ml）。然后根據(jù)需要進行倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度： 2500、1250、625、312.5、156.2、78.1、39.05、0 pg/ml。樣品稀釋液直接作為空白孔 0 pg/ml。如配制2500pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）5000pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

4. 生物素化抗體工作液：實驗前計算當(dāng)次實驗所需用量（以100μl/孔計），實際配制時應(yīng)多配制100-5. 酶結(jié)合物工作液：實驗前計算當(dāng)次實驗所需用量（以100μl/孔計），實際配制時應(yīng)多配制  100-200μl。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體（1:100）成工作濃度。當(dāng)日使用。

洗滌方法:

1. 自動洗板機：每孔加入洗滌液350μl，注入與吸出間隔60秒。洗板5次。

2. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μl，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干。洗板5次。

操作步驟:

實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

1、 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育2小時。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2、 棄去液體，甩干，每個孔中加入Detection Ab工作液 100μl（在使用前15分鐘內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1小時。

3、 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μl /每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。

4、 每孔加HRP Conjugate工作液（臨用前15分鐘內(nèi)配制）100μl，加上覆膜，37℃溫育1小時。

5、 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。

6、 每孔加底物溶液100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右（根據(jù)實際顯色情況酌情縮短或延長，但不可超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止）。

7、 每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。

8、 立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度（OD值）。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測程序。

9、 實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結(jié)束。

實驗操作注意事項：

1、 保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊或旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

2、 酶標(biāo)板：剛開啟的酶標(biāo)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

3、 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。每次的加樣時間控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔實驗。

4、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時必須給酶標(biāo)板覆膜；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)；嚴(yán)格遵守給定的溫育時間和溫度。

5、 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。在讀數(shù)前要注意清除孔底殘留的液體和手指印，以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。

6、 試劑配制：Detection Ab及HRP Conjugate體積較小，運輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用前請手甩幾下或1000轉(zhuǎn)/分離心1min，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標(biāo)準(zhǔn)品、Detection Ab工作液、HRP Conjugate工作液請依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請精確配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Detection Ab時，一次不要小于10μl），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、Detection Ab工作液、HRP Conjugate工作液。若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次用量分裝，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復(fù)凍融。

7、 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很明顯，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免顏色過深影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。

8、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

9、  混勻：充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器（使用zui低頻率），如無微     量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。

10、 安全：試驗中請穿著試驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液標(biāo)      本時，請按國家生物試驗室安全防護條列執(zhí)行。

11、 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外）

12、 試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴(yán)禁混用，否則將影響試驗結(jié)果！