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技術(shù)文章

糖基轉(zhuǎn)移酶活性分析

閱讀:1883          發(fā)布時間:2012-7-11

R&D Systems現(xiàn)已開發(fā)出一種多功能的非放射性檢測方法,能測定糖基轉(zhuǎn)移酶活性。分析使用了一種特定的磷酸酶,它釋放糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)過程中產(chǎn)生的核苷酸上的磷酸。隨后利用孔雀石綠磷酸鹽檢測試劑來評估磷酸鹽水平。因為釋放的磷酸鹽濃度與轉(zhuǎn)移的糖分子量成正比,所以可測定糖基轉(zhuǎn)移酶的動力學(xué)參數(shù)。此外,這種顯色分析在96孔板中開展,適合高通量研究

 糖基轉(zhuǎn)移酶是催化單糖基團(tuán)從糖基供體向受體底物轉(zhuǎn)移的酶。其中大部分被歸為Leloir酶,它們利用核苷酸糖作為供體,并在反應(yīng)中核苷酸磷酸鹽。分析糖基轉(zhuǎn)移酶活性相當(dāng)具有挑戰(zhàn)性。zui常用的方法是檢測放射性標(biāo)記的糖從供體轉(zhuǎn)移到受體分子。各種非放射性的檢測方法也被不斷開發(fā);然而,它們中的大部分是為特定糖基轉(zhuǎn)移酶定制的。

為了證明這種技術(shù)的實用性,我們評估了Clostridium difficile毒素B(TcdB;圖2A)、人O-糖基轉(zhuǎn)移酶I(KC1;圖2B)和人ST6GAL1(圖2C)的酶活。TcdB和KC1是具有UDP-葡萄糖水解酶活性的糖基轉(zhuǎn)移酶,它們在反應(yīng)中副產(chǎn)物UDP。磷酸酶CD39L3水解核苷酸β-磷酸鹽,并從UDP上釋放出游離的磷酸鹽。相比之下,ST6GAL1是唾液酸轉(zhuǎn)移酶,它催化了N聚糖中唾液酸從α2,6轉(zhuǎn)移到β 1-4GlcNAc結(jié)構(gòu)。對于此反應(yīng),CMP-NeuAc充當(dāng)供體底物,而N-乙酰乳糖胺(LN)則充當(dāng)受體。利用5’核苷酸酶CD73從反應(yīng)中產(chǎn)生的CMP上釋放出游離的磷酸鹽。對于這三種糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng),利用孔雀石綠檢測試劑測定游離磷酸鹽水平,以獲得相對供體底物濃度的特定活性(pmol/min/µg)的準(zhǔn)確測定(圖2)。

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